FTY720对乳腺癌MCF-7细胞增殖及Bax/Bcl-2基因表达的影响

FTY720对乳腺癌MCF-7细胞增殖及Bax/Bcl-2基因表达的影响

张淑芳方芳1李琼书靳丹虹台桂香

(长春医学高等专科学校生化教研室,吉林长春130031)

摘要〔〕目的探讨FTY720对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及Bax/Bcl-2基因表达的影响。方法FTY720作用人乳腺癌细胞29 h，观察细胞形态，应用Western印迹检测细胞Bax/Bcl-2基因表达；FTY720作用人乳腺癌细胞48 h，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率，通过流式细胞术(FCM)检测细胞周期、凋亡率。结果镜下可见FTY720作用组细胞生长不良；MTT法检测到该细胞的增殖受到不同程度的抑制，当FTY720浓度为6 400 ng/ml时，体外培养MCF-7细胞抑制率为62.0%，抑制率呈浓度依赖性(P<0.05)；流式细胞术检测分析显示，FTY720可将该细胞周期阻滞于G1期，细胞凋亡率也较对照组明显增加(P<0.05)；Western印迹法检测分析显示，实验组细胞中Bax/Bcl-2蛋白表达水平比值均较对照组明显增高(P<0.01)。结论一定浓度的FTY720可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，诱导其发生凋亡，激活细胞凋亡基因Bax、抑制原癌基因Bcl-2表达。

关键词〔〕FTY720；人乳腺癌细胞(MCF-7)；凋亡；抗肿瘤作用

中图分类号〔〕R737.9〔

基金项目：吉林省卫生厅科研项目(2011ZC016)；吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目资助课题(2010-465)

通讯作者：台桂香(1964-)，女，教授，博士，主要从事肿瘤免疫研究。

1吉林医药学院免疫学教研室

第一作者：张淑芳(1973-)，女，教授，硕士，主要从事肿瘤免疫研究。

FTY720是由冬虫夏草分离出的活性成分多球壳菌素(ISP-1)，经结构改造而成的化合物，它作为一种新型免疫抑制剂被研究。近些年有研究发现，FTY720对某些肿瘤细胞的生长有抑制作用，可诱导人胰腺癌Miopac2细胞、裸鼠人肝癌细胞系MHCC-97H、白血病细胞HL-60、K562等凋亡〔1～3〕，但就其诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其机制的研究，国内未见报道。本文研究FTY720对人乳腺癌细胞的作用及其机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂人乳腺癌(MCF-7)细胞本研究室保存。FTY720购自美国BioVision公司。四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)购于北京鼎国生物技术公司。RPMI 1640培养基、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒为碧云天生物技术有限公司产品。小牛血清为杭州四季青公司产品。鼠抗β-actin单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2和Bax单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2主要方法

1.2.1细胞培养取人乳腺癌MCF-7细胞用含10%小牛血清、100 U/ml 青霉素及100 U/ml 链霉素的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2孵箱常规培养，24～48 h换液、传代1次。

1.2.2药物作用细胞收集对数生长期的MCF-7细胞，调细胞浓度至5×104个/ml，接种于培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后给药。实验设药物处理组和阴性对照组：药物处理组每孔加入FTY720溶液使其终浓度达到25.6 μg/ml，阴性对照组不加药物，37 ℃、5%CO2培养箱培养29 h，倒置显微镜下观察各组细胞，拍照。

1.2.3MTT法检测细胞增殖抑制率收集对数生长期的MCF-7细胞，调细胞浓度至5×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔加100 μl细胞悬液，置37 ℃、5%CO2培养箱内培养24 h后给药。实验设药物处理组、阴性对照组和空白对照：药物处理组每孔加入100 μl FTY720溶液使其终浓度分别达到400、800、1 600、3 200及6 400 ng/ml，阴性对照组不加药物，空白对照组只加RPMI1640培养液，各浓度组均设3复孔，37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h，每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl ，继续孵育4 h后，弃上清液，加入150 μl DMSO，轻轻振荡10 min，用酶标仪于490 nm 波长处测吸光度(OD)值，求平均值，计算药物对细胞生长增殖的抑制率。细胞生长抑制率=(1-药物处理组OD值/阴性对照组OD值)×100%。

1.2.4流式细胞仪检测细胞周期及凋亡取对数生长期细胞给药，同时设阴性对照，FTY720终浓度分别为800、1 600、3 200 ng/ml，作用细胞48 h后收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml。1 000 r/min，离心5 min，弃上清，PBS缓冲液洗涤2次，70%乙醇4 ℃固定过夜，以50 μg/ml的PI 37℃避光染色30 min，用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。

1.2.5Western印迹法检测Bax、Bcl-2基因表达取对数生长期MCF-7细胞，常规培养24 h后加入药物FTY720， FTY720终浓度分别为1.6、3.2、6.4、12.8及25.6 μg/ml，同时设不加药物的阴性对照组，继续培养29 h，取各组细胞，分别(按试剂盒说明书操作)加入预冷的RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞后，离心5 min，收上清液用BCA法测各组总蛋白含量。将电泳装置固定好，配10%分离胶，灌胶。待分离胶凝后，注入4%浓缩胶。浓缩胶凝后，拔掉梳子，取各组蛋白30 μg加样，进行电泳。将上述SDS-PAGE电泳分离后的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，经50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，加鼠抗人Bcl-2和Bax(1∶400稀释)单克隆抗体及鼠抗β-actin单克隆抗体(1∶2 000稀释)，4℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，DAB显色。胶片经扫描后获得图像，以目的条带与内参照的光密度比值表示蛋白表达。

1.3统计学方法采用SPSS13.0软件进行方差分析和t检验。

2结果

2.1细胞形态将对照组和药物作用组细胞常规培养29 h，光学显微镜下可见：对照组细胞生长旺盛，呈多边形贴壁生长，胞质饱满，细胞轮廓清晰，折光性强；药物作用组(FTY720 25.6 μg/ml)细胞生长不良，细胞变圆，大小不一，不贴壁，胞质较少，细胞内可见明显颗粒，部分细胞结构不完整，呈碎片状，折光性差(图1)。

2.2细胞增殖抑制率MTT法检测显示，浓度为400、800、1 600、3 200、6 400 ng/ml的FTY720作用48 h后，对MCF-7细胞的增殖均有一定程度抑制作用，抑制率分别为12.2%、23.8%、26.9%、36.3%、62.0%，呈浓度依赖性。与400 ng/ml组，1 600 ng/ml和6 400 ng/ml抑制率有差异。

2.3细胞周期及凋亡检测经流式细胞仪检测分析显示，与对照组相比，随药物浓度增加，实验组处于G1期的细胞逐渐增多，S期细胞明显减少(表1)，表明FTY720可将其细胞周期阻滞于G1期；细胞凋亡率也较对照组明显增加(P<0.05)。

对照组　　　　　　　　　　药物作用组 图1　光学显微镜下MCF-7形态(×100)

2.4Bax、Bcl-2基因表达Western印迹结果显示，与对照组相比，不同浓度FTY720作用各组MCF-7细胞的Bax蛋白丰度增加、灰度减小，Bcl-2蛋白丰度减小、灰度增加，说明FTY720作用各组MCF-7细胞的Bax蛋白表达水平均增加，而Bcl-2蛋白表达水平减少；Bax与Bcl-2蛋白表达水平比值均较对照组明显增高(P<0.01)。3.2、6.4、12.8、25.6 μg/ml FTY-720对应的Bax/Bcl-2蛋白水平比值分别为2.12、2.426、2.05、2.185。

表1FTY-720对MCF-7细胞周期及凋亡的影响

分组G1期S期G2期凋亡率对照组57.5±0.02130.6±0.03111.9±0.0124.22±0.015800ng/ml60.8±0.01821.5±0.02617.7±0.0345.64±0.0091)1600ng/ml66.3±0.03220.3±0.01113.4±0.0135.46±0.0021)3200ng/ml67.2±0.02219.6±0.04213.2±0.0096.86±0.0121)

与对照组比较：1)P<0.05

3讨论

FTY720是将传统中药冬虫夏草抽提物中的成分ISP-1进行结构改造而成的新物质，因由日本的Fujita教授(Taito公司)和Yoshitomi药品公司共同研制成功而得名〔4〕。目前，FTY720的抗肿瘤作用已引起研究者的关注。有实验证实， FTY720能诱导HL-60、Jurkat、实体膀胱肿瘤细胞、人胰腺癌等多种肿瘤细胞系凋亡〔1～3〕。本研究表明FTY720可诱导MCF-7肿瘤发生凋亡，且这种作用存在剂量依赖性。为进一步验证FTY720是否诱导MCF-7细胞发生凋亡，Bcl-2基因是原癌基因，其突出作用是抑制细胞凋亡。 Bax基因是一种促凋亡基因，上调Bax蛋白水平可以促进细胞凋亡。本研究结果显示，一定浓度的FTY720不但可诱导MCF-7细胞发生凋亡，同时也说明其可激活细胞凋亡基因Bax、抑制原癌基因Bcl-2表达，这可能是FTY720抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、诱导其凋亡的机制之一。

张丹丹〔5〕研究发现：FTY720对人卵巢癌细胞系SKOV3的生长抑制具有剂量时间依赖性，其可诱导该细胞发生G1期阻滞而诱导该细胞发生凋亡。本研究结果说明FTY720诱导人卵巢癌细胞系SKOV3和人乳腺癌MCF-7细胞发生阻滞的细胞周期相同，均可通过将细胞阻滞于G1而诱导细胞发生凋亡。刘赟等〔6〕研究结果提示：FTY720对肝癌细胞HepG-2侵袭能力具有抑制作用，并随FTY720浓度的升高侵袭能力逐渐下降，其机制之一可能是降低了肝癌细胞MMP-2、MMP-9的蛋白质及基因表达。张丹丹〔5〕研究结果显示FTY720可能是通过激活内源性Caspase途径而诱导SKOV3细胞发生凋亡。而本研究结果显示FTY720可能是通过影响MCF-7细胞中Bax与Bcl-2基因表达而诱导该细胞发生凋亡。上述研究结果提示：FTY720可能是通过不同的机制诱导不同的肿瘤细胞系发生凋亡。

本研究提示FTY720可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖，诱导其凋亡，激活促凋亡Bax基因表达、抑制原癌基因Bcl-2表达。但关于FTY720对MCF-7细胞的作用还需进一步研究。

4参考文献

1王瑞，何景华.FTY720抑制人胰腺癌Miopac2细胞株增殖的研究〔J〕.天津医科大学学报，2008；14(4)：445-7.

2肖江卫，王崇树，魏寿江，等.FTY720抑制裸鼠人肝癌细胞系MHCC-97H移植瘤生长的实验研究〔J〕.实用癌症杂志，2010；25(2)：122-5.

3李登举，张瑶珍，黄伟，等.新型免疫抑制剂FTY720诱导HL-60和K562细胞凋亡的作用机制〔J〕.中华血液学杂志，2003；24(12)：663-4.

4Fujita T,Inoue K,Yamamoto S,etal.A potent immunosupptessive activity found in Isaria sinclairii metabolite〔J〕.J Antibiot,1994;47(2):208.

5张丹丹.FTY720对人卵巢癌细胞系SKOV3诱导凋亡的研究〔J〕.黑龙江医学，2010；20(10)：723-6.

6刘赟，臧世利，赵浩亮.FTY720对人类肝癌细胞HepG-2侵袭能力的影响〔J〕.肿瘤研究与临床，2010；22(5):315-8.

〔2013-07-12修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)