生姜提取物对阿尔茨海默病大鼠行为学功能的影响

生姜提取物对阿尔茨海默病大鼠行为学功能的影响

曾高峰张志勇鲁力肖德强宗少晖1何建明

(广西医科大学公共卫生学院，广西南宁530021)

摘要〔〕目的研究生姜提取物对β淀粉样蛋白(Aβ)所致阿尔茨海默病(AD)大鼠行为学及大脑神经细胞形态学的影响。方法SD健康大鼠60只，雌雄各半，随机分成生假手术组和手术组，分别为10只和50只，假手术组侧脑室注射生理盐水，手术组侧脑室注射Aβ25～35。造模成功后，建立假手术组(SOP)8只，再将手术组47只随机分成生姜提取物低、中、高剂量组、石杉碱甲组及空白对照组。各组大鼠予灌胃相应药物(空白对照组予等量生理盐水)4 w后，通过Morris水迷宫法评价大鼠学习记忆能力，并以病理组织切片评价大脑病理形态学改变。结果生姜提取物高剂量组、石杉碱甲组潜伏期明显缩短，神经元细胞数量、层数及胞内尼氏小体增多，在低、中剂量组干预效果不显著。结论高剂量生姜提取物对AD大鼠具有提高学习记忆能力的作用。

关键词〔〕阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白(Aβ)；行为学；形态学

中图分类号〔〕R742〔

基金项目：广西卫生厅中医药管理局课题资助(NO.03301211027)

1广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科

第一作者：曾高峰(1975-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事人类营养学研究。

阿尔茨海默病(AD)无比较有效的治疗手段，最主要是由于AD不清晰的病因及复杂的发病机制〔1～5〕，AD确切的病理损伤机制仍然是现阶段医学界争论的难点〔6〕。生姜块茎中含有多种成分，其中有姜辣素、姜精油、姜酚及黄酮等，还含有多种微量元素〔7〕。本研究通过立体定位仪予侧脑室注射β-淀粉样蛋白(Aβ)25～35及氯化铝溶液灌胃建立AD大鼠动物模型，观察在体条件下生姜提取物对Aβ25～35致AD大鼠学习记忆能力方面的形态学及神经细胞病理形态学的影响，并进一步探讨生姜提取物对AD的疗效及其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级健康SD大鼠(雌雄各半)60只，体重210～280 g。购于广西医科大学动物实验中心，本实验研究符合广西医科大学动物保护委员会标准要求，实验中尽可能减少动物使用数量和减轻动物痛苦。动物予适应性喂养1 w。

1.2试剂生姜提取物：含量为5%姜辣素6-姜辣醇、6-生姜酚、8-姜辣醇、10-姜辣醇，其中6-姜辣醇为主要成分。由上海灵菱食用菌科技有限公司提供。Aβ25～35250 μg(美国Sigma公司)加入无菌生理盐水，制成1 g/L的溶液，保持在37℃恒温箱孵育3～7 d，使其老化并成为聚集态的Aβ25～35。

1.3主要仪器SR-5R型脑立体定位仪 (日本成茂公司)；微量注射器 (上海医用激光仪器厂)；光学显微镜(XSP-12C)(上海永亨光学制造有限公司)；病理图像分析仪(DMR+Q550)(德国LEICA公司)；MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统。

1.4AD造模方案将大鼠用10%水合氯醛(0.5 μl/g)麻醉，固定于脑立体定位仪上，对耳线跟上颌骨三角固定，保持头盖骨水平。剪去头顶部毛发，碘酊消毒并75%酒精脱碘后切开皮肤，参考Paxinos&Watson的方法选取大鼠侧脑室〔8〕，于前囟向后0.8 mm，中线旁开1.4 mm处，三棱针钻开颅骨，暴露硬脑膜，再用微量注射器缓慢自脑表面垂直进针3.6 mm，将Aβ25～35缓慢注入5 μl(约10 min)，假手术组侧脑室注射等量无菌生理盐水，留针10 min后缓慢撤针，撒些许青霉素粉后，缝合切口，并用碘伏消毒切口。单笼单只饲养待全部大鼠完全清醒并恢复活动。术后应用抗生素，连续3 d肌注青霉素(广西医科大学第一附属医院药剂科提供)10万U/次，2次/d和庆大霉素(广西医科大学第一附属医院药剂科提供)1 000 U/次，2次/d。

1.5氯化铝灌胃待全部大鼠完全清醒并恢复活动并术后愈合后，每日予3%氯化铝100 mg/kg灌胃。持续30 d。

1.6用药生姜低、中、高剂量组分别予剂量为10、20、40 g/kg生姜水，每只大鼠每日剂量以生理盐水兑至5 ml，分2次灌胃；石杉碱甲组予石杉碱甲片100 mg/kg，磨碎后兑生理盐水至每只大鼠5 ml，分两次灌胃；空白对照组每只大鼠予生理盐水5 ml，分2次灌胃；假手术组不予处理。灌胃用药持续20 d。

1.7Morris水迷宫评价行为学用药结束后进行Morris水迷宫评价大鼠学习记忆能力。水池温度保持在(25±3)℃。将大鼠分别从水池四个象限面向池壁随机放入水池中，观察大鼠在四个象限找到平台的时间(潜伏期)，超过120 s后统一记录成绩为120 s。120 s后大鼠还找不到平台的，引导其到平台上休息60 s。取四个象限平均值为该次实验的成绩。实验每天进行1次，持续5 d。

1.8组织取材及常规HE及尼氏染色将大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，取血后快速开胸，将针尖磨平的20 ml注射器针经左心室心尖穿刺达到主动脉插管，并血管钳夹固定针，以500 ml冷生理盐水快速冲洗直至流出澄清液，以4%多聚甲醛400 ml灌注固定，维持约60 min。待双上肢硬化后除去颅盖骨，取出完整的大脑组织，用上述固定液固定24 h后，取大脑后1/3海马区丰富为标本，常规脱水，石蜡包埋，作连续冠状切片，片厚4～5 μm。常规脱蜡。制得切片后常规HE染色及尼氏染色。每张切片于400倍镜下取10个不同视野，采用病理图像分析仪及Leica QWIN图像分析软件相结合分析同期制作的常规HE及尼氏染色切片。

1.9统计学方法采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和多重比较(LSD)。

2结果

2.1常规HE及尼氏染色各组在细胞数量、细胞形态和组织结构发生比较明显的变化(P<0.05)。神经元细胞数量及胞内尼氏小体明显增加(见表1)；神经元细胞较大，细胞质增多，细胞核固缩程度减轻；神经元排列较整齐，神经元纤维缠结少，细胞层数增多，胶质细胞减少，色深染减轻。

2.2Morris水迷宫空间探索第1天假手术组较生姜提取物组及空白对照组潜伏期明显缩短(P<0.05)；第2天生姜提取物高剂量组、石杉碱甲组及假手术组较空白对照组潜伏期明显缩短(P<0.05)，生姜提取物低剂量组较假手术组明显延长(P<0.05)；第3、4、5天生姜提取物高剂量组、石杉碱甲组及假手术组较生姜提取物低剂量组、中剂量组及空白对照组潜伏期明显缩短(P<0.05)。见表2。

组别n神经元细胞尼氏小体生姜提取物低剂量组1034.17±7.053)4)5)9.27±3.123)4)5)生姜提取物中剂量组1039.58±7.453)4)5)12.51±4.693)4)5)生姜提取物高剂量组1069.32±10.411)2)6)22.54±5.361)2)6)假手术组876.18±9.511)2)6)27±8.091)2)6)石杉碱甲组1071.23±11.111)2)6)24.37±8.231)2)6)空白对照组733.25±6.133)4)5)9.74±4.433)4)5)

与生姜提取物低剂量组比较：1)P<0.05；与生姜提取物中剂量组比较：2)P<0.05；与生姜提取物高剂量组比较：3)P<0.05;与假手术组比较：4)P<0.05;与石杉碱甲组比较：5)P<0.05;与空白对照组比较：6)P<0.05，下表同

组别n1d2d3d4d5d生姜提取物低剂量组10100.38±33.344)92.31±29.544)87.10±22.173)4)5)82.13±16.343)4)5)60.81±15.953)4)5)生姜提取物中剂量组1096.06±23.5690.19±19.3083.06±19.413)4)5)84.88±20.083)4)5)53.63±14.073)4)5)生姜提取物高剂量组1097.63±22.4183.26±17.76f54.19±17.261)2)6)44.63±18.931)2)6)38.31±15.271)2)6)假手术组884.17±17.251)6)78.09±18.711)6)49.42±16.541)2)6)39.92±13.021)2)6)28.67±12.791)2)6)石杉碱甲组1094.19±25.5678.88±19.31f44.13±17.121)2)6)38.13±15.101)2)6)32.69±14.891)2)6)空白对照组7103.42±27.834)98.5±21.273)4)5)95.25±20.873)4)5)85.17±18.033)4)5)70.08±21.053)4)5)

3讨论

Aβ具有神经毒性作用，能直接引起神经元的死亡和诱导的神经细胞凋亡都已被证实〔9〕， Aβ是AD形成并发展的主要因素。因此本研究以Aβ和氯化铝双干预建立AD大鼠模型〔10〕。关于AD的发病机制，目前比较认可的假说为氧化应激假说、能量代谢假说、淀粉样蛋白级联反应假说以及胆碱能假说等〔11〕，除此之外，还有Aβ神经毒性假说、自由基损伤假说及大脑局部炎症假说。记忆障碍及学习能力的缺失是AD早期的突出临床表现，其程度与丢失的及丧失功能的突触数目相关甚密〔12〕。这在一定程度上说明神经元细胞数目多寡与记忆学习能力强弱等方面密切相关。尼氏小体的本质是糙面内质网的核糖体，与神经递质的分泌相关，可作为检测神经元细胞活性的形态学标准，乙酰胆碱是大脑海马区最主要的神经递质，大脑内海马区主要与学习记忆相关，尤其在空间记忆学习的获得、储存和提取等一系列过程中发挥重要作用〔13，14〕。本研究提示生姜提取物在高剂量时能提高AD大鼠学习记忆能力。

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〔2013-03-13修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)