丙型肝炎病毒1a、1b 和2a 型 E1E2原核质粒的构建和序列分析

丙型肝炎病毒1a、1b和2a型E1E2原核质粒的构建和序列分析

胥冰黄峰霍慧春1

(陕西中医学院医学技术系免疫及检验教研室，陕西咸阳712046)

摘要〔〕目的构建陕西地方株丙型肝炎病毒(HCV)1a、1b和2a型包膜糖蛋白E1E2的原核质粒并测序比对。方法采用逆转录-巢式聚合酶链反应(RT- nest PCR)扩增获得HCV 1a、1b和2a型E1E2片段，与pMD-18 simple vector连接，转化感受态细菌DH5α，小量提取质粒DNA并测序。测序结果与Gene bank中其他标准序列比对以获取同源性数据。同时重点分析E2蛋白高变区(HVR)1和2氨基酸序列。MEGA 4软件绘制种系进化树图。结果成功扩增约2 kb的目的片段并构建原核质粒，测序结果正确。1b亚型E1E2的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。HCV E2的HVR1和2的序列比对显示，同种基因亚型在HVR 1的变异性最大，而HVR 2的序列变异性不显著。不同基因亚型的毒株在HVR 1和2的变异性极大，而1b亚型在HVR 1和2的变异性比1a和2a型突出。结论陕西地方株HCV 1b型E1E2区比1a和2a型更易发生突变，1b型E2的HVR变异性更显著。

关键词〔〕丙型肝炎病毒；包膜糖蛋白；基因型；序列分析

中图分类号〔〕R512.6〔

基金项目：陕西科学技术厅自然科学研究项目资助(No.SJ08C232)

1陕西绥德名州镇卫生院

第一作者：胥冰(1968-)，女，硕士，副教授，主要从事中医药免疫学研究。

丙型肝炎主要是由丙型肝炎病毒(HCV)经血液传播引起的一种疾病，丙型肝炎所致肝硬化和肝癌以老年患者居多〔1〕。HCV为单股正链RNA病毒，基因组全长约9.6 kb。由于HCV所依赖的RNA聚合酶缺乏校正功能，导致基因组在序列上表现出极大的异质性，因此，依据序列同源性的差异，可将HCV区分为6种主要的基因型和不同的亚型。各种基因型和亚型的分布存在一定的地域差异，在我国以1型和2型为主〔2〕。在HCV基因组中，以包膜糖蛋白E1E2区的变异度最大，而E1E2在病毒吸附宿主细胞和保护性免疫方面具有重要作用〔3〕。本研究对陕西省HCV 1a、1b和2a型毒株的E1E2区进行RT-PCR扩增并构建原核质粒，将E1E2测序结果与已发表的毒株进行同源性比对分析。

1材料与方法

1.1质粒、菌种和主要试剂DH5a感受态细菌由本校生化教研室制备。AMV逆转录试剂盒(Promega公司)。LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T Simple Vector和DNA Marker(Takara公司)。DNA凝胶纯化和质粒小量提取试剂盒(Axygen公司)。

1.2血标本三份HCV血清取自陕西中医学院附属医院丙型肝炎患者，均为男性，年龄63～71岁。

1.3方法

1.3.1HCV RNA提取和cDNA合成采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从血清样本中提取HCV RNA，全部RNA溶于10 μl DEPC水中。按照AMV逆转录试剂盒说明书，加入随机引物及AMV逆转录酶于42 ℃水浴中逆转录60 min，逆转录产物cDNA保存于-20℃。

1.3.2HCV E1E2的引物及PCR扩增以Gene Bank中HCV H77(1a)、HCV-J(1b)和JFH1(2a)株序列为模板，参照文献设计扩增E1E2 基因序列的引物，见表1。引物均由上海生物工程公司合成。

采用巢式PCR法，按照LA Taq DNA聚合酶说明书进行操作。将4 μl cDNA加入PCR体系(LA Taq酶、DEPC水中，加入正向和反向的外引物共50 μl，第一轮PCR反应程序为95℃ 4 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 3 min，35循环；72℃延伸10 min。取第一轮PCR产物5 μl加入50 μl体系中，加正向和反向的内引物进行第二轮PCR，反应程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35循环；72 ℃延伸10 min。扩增终产物取3 μl于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外成像仪观察结果。

1.3.3原核质粒的构建凝胶纯化HCV E1E2目的条带，与pMD18-T Simple Vector进行TA克隆连接，转化DH5a感受态细菌，涂布Amp + LB 平板中，37 ℃孵育过夜，挑取阳性克隆，扩增后小量提取并纯化质粒。纯化后的质粒DNA送上海生物工程公司测序鉴定。

1.3.4序列比对和进化树分析将所获得HCV1a、1b、2a型 E1E2的核苷酸序列及氨基酸序列分别与已报道的1a：H77(AF009606)、HC-J1(D10749)；1b：HCV-J(D90208)、HC-C2(D10934)；2a：JFH1(AB047639)、HC-J6(D00944)的E1E2序列进行同源性比较。并且利用MEGA 4软件绘制种系进化树。

表1HCV E1E2引物的序列及位置

引物极性位置(nt)序列(5'-3')1)长度1a外引物S1-1/A1-1+/-42～61/2670～2689CCCCTGTGAGGAACTACTGTACCCACCTACCCTTCAGATA2648bp内引物S1-2/A1-2+/-597～614/2641～2659TATGGCAATGAGGGTTGCCAGAAGAACACGAGGAAGG2063bp1b外引物S2-1/A2-1+/-74～92/2658～2676TGGCGTTAGTATGAGTGTTCCAGCCTGCCTTTGATGTA2603bp内引物S2-2/A2-2+/-585～603/2631～2649TATGGCAACGAGGGTATGGCGCAGAAGAACACGAGGAA2065bp2a外引物S3-1/A3-1+/-85/2770～2786TGGCGTTAGTATGAGTGTCGGCGTCATAAGCATAAGCC2703bp内引物S3-2/A3-2+/+721～739/2770～2786CCGACCTCATGGGGTACATGCGTCATAAGCATAAGCC2056bp

1)引物位置参考标准株：1a：HCV H77株；1b：HCV J株；2a：JFH1株

2结果

2.1逆转录-聚合酶链反应结果HCV1a、1b和2a亚型E1E2区段的RT-PCR产物全长约为2 kb，图1为扩增产物的电泳图，条带清晰，大小符合预期。

M:250 bp DNA分子量标准；N：阴性对照；WXR-1a、LSG-1b和ZKX-2a为不同HCV基因型标本的阳性结果 图1　HCV E1E2扩增终产物电泳图

2.2HCV E1E2序列比对将E1E2测序序列上传Gene Bank网站，与对应的基因亚型序列进行BLAST比对。可见1b亚型的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。见表2。同时分析HCV E2的高变区(HVR)1和2的序列变异。可见同种基因亚型在HVR 1的变异性最大，而HVR 2的序列变异性不显著。不同基因亚型的毒株在HVR 1和HVR 2的变异性极大。1b亚型在HVR 1和HVR 2的变异性比1a和2a型突出。见图2。

2.3HCV E1E2的种系进化树可见WXR、LSG、ZKX分别为1a、1b和2a亚型毒株。1a与1b亚型在种系进化树中距离较近，与2a亚型距离较远。见图3。

表2同种亚型E1E2区核苷酸及氨基酸的同源性比较(%)

E1E2WXR-1aH77 HC-J1LSG-1bHCVJ HC-C2ZKX-2aJFH1 HC-J6核苷酸90.589.365.466.596.287.8氨基酸92.791.687.189.097.288.9

HVR1区HVR2区

图2HVR序列比对

图3HCV E1E2种系进化树3讨论

HCV感染可造成急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌等〔4〕。全球HCV的感染率约为3%。我国抗-HCV阳性率约为3.2%，共有近4 000万人感染HCV〔2〕。庞大的感染人群加上HCV病毒感染的慢性、隐匿、无疫苗可用等特点，给社会发展带来沉重的疾病和经济负担。HCV存在6种基因型和多种亚型，基因组间的变异性较大，以包膜糖蛋白区(E1E2蛋白)的变异度最高〔5〕。对HCV E1E2蛋白的研究是肝病研究的焦点问题，有助于解答HCV与宿主细胞的吸附感染机制以及保护性疫苗的研发等。

本实验结果发现中国陕西地方毒株HCV 1b亚型E1E2核苷酸序列与HCV-J株、HC-C2株比较，同源性较差，但比对其氨基酸序列，发现同源性较高。说明该1b亚型毒株E1E2区核苷酸突变频率极高，但多是同义突变。同时，在相同亚型与不同亚型间比较E2蛋白的HVR 1和2序列，发现1b亚型的变异性比1a和2a型突出。这些结果说明HCV 1b亚型病毒的包膜糖蛋白区更易发生突变，造成复杂的准种现象，从而逃避的机体的免疫识别，也影响临床干扰素(IFN)治疗的疗效〔6〕。

HCV E2蛋白的高变区存在中和抗原表位，该抗原表位能够诱导机体免疫反应，产生保护性抗体，从而阻止HCV的感染。但是高变区序列呈现高度变异性，易发生抗原漂移，导致HCV逃避机体免疫系统的识别监控，引起丙型肝炎的慢性化〔2〕。本研究显示相同亚型病毒的E2蛋白的高变区变异较小，相同亚型的基因低变异率为研发同亚型毒株的疫苗提供了条件，但是机体产生的保护性抗体可能存在株特异性，在其他亚型病毒的免疫保护作用较弱或无保护作用。提示对HVR 1和2的抗原表位综合比对，研发多价多肽疫苗或复合基因疫苗，可能会对不同亚型毒株的感染起到交叉免疫保护作用。

4参考文献

1朴红心，金清龙，张英哲，等.朝鲜族老年慢性丙型肝炎患者的临床特征及感染危险因素〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(22)：4359-60.

2中华医学会肝病学分会，中华医学会传染病与寄生虫病学会.丙型肝炎防治指南〔J〕.中华肝脏病杂志，2004；4(12)：194-8.

3闵峰，郝飞.丙型肝炎病毒包膜糖蛋白与保护性免疫〔J〕.世界华人消化杂志，1999；7(12)：1065-7.

4史跃杰.579 例原发性肝癌患者乙肝病毒与丙肝病毒血清学标志物分析〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(15)：2820-1.

5Simmonds P,Bukh J,Combet C,etal.Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes〔J〕.Hepatology(Baltimore,Md.),2005;42(4):962-73.

6李雪黎，雷宇，钟珊，等.基于2a基因型丙型肝炎病毒自身启动子的单顺反子复制子的构建和功能测定〔J〕.中华肝脏病杂志，2012；20(2)：103-7.

〔2013-11-21修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)