中药复方“益肾固冲汤”对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖及凋亡的影响

中药复方“益肾固冲汤”对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖及凋亡的影响

白羽臧学丽1张超2崔桂花李文亮薛莹雪肖萧徐广宇3闫魏魏4

(吉林医药学院药学院，吉林吉林132001)

摘要〔〕目的探讨益肾固冲汤抑制乳腺癌细胞增殖，促进其凋亡的作用和抗癌分子的机制。方法体外培养人乳腺细胞株(MCF)-7细胞利用MTT法观察益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用，用流式细胞仪检测益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7凋亡及细胞周期的影响。结果益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞增殖具有抑制作用，都具有明显的时-效和量-效关系。人乳腺癌细胞MCF-7细胞经过不同浓度的益肾固冲汤处理24、48、72 h后，各组均呈现不同程度的凋亡，且凋亡率随着计量的增加、时间的延长而逐渐增加。益肾固冲汤在40 μg/ml量、作用72 h时具有统计学差异，细胞凋亡率最高，达17.93%，与正常对照组相比，G0/G1期细胞比率随作用时间延长在逐渐减少，G2/M期的细胞比率随作用时间延长在逐渐增加，细胞生长周期较明显停滞在G2/M期，具有明显时间依赖性。结论益肾固冲汤可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，诱导细胞凋亡，具有明显的量效和时效关系。细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用与G2/M期有关。

关键词〔〕益肾固冲汤；乳腺癌；人乳腺癌细胞株；抑制增殖；细胞凋亡

中图分类号〔〕R73〔

基金项目：吴阶平基金(No.320.6750.13229)，吴阶平基金(No.320.6750.13216)，吉林教育厅“十二五”科学技术研究课题(No.〔2014〕505)

通讯作者：闫魏魏 (1989-)，男，硕士，主要从事急慢性腹痛的诊断与治疗研究。

1长春高等医学专科2吉林大学基础医学院

3北华大学药学院4吉林大学第一附属医院

第一作者：白羽(1980-)，女，讲师，博士，主要从事中药成分分析研究。

目前临床常用的治疗乳腺癌主要有内分泌治疗、放射治疗、化疗、诱导分化治疗等。但是，几乎都存在作用靶点单一，疗效不尽人意，毒副作用大等缺点。我国传统的中药复方，有望成为突破这些瓶颈辅助的利器。本实验选用中药复方“益肾固冲汤”对激素依赖性肿瘤乳腺癌激素受体的人乳腺癌细胞株(MCF-7)雌激素受体(ER+)进行研究。通过研究复方在生理剂量环境及药理剂量环境下对MCF-7细胞增殖及凋亡的影响，为中药在乳腺癌的辅助治疗中的安全性和有效性提供实验室依据及理论基础。

1材料与方法

1.1实验药物MCF-7由南京凯基生物科技发展有限公司提供，完全培养基为90%RPMI-1640+10%胎牛血清(FBS)，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。益肾固冲汤，购买于吉林大药房。青霉素、链霉素混合液，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，RPMI-1640(美国GIBCO)，二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Amresco)，膜联蛋白V荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。

1.2主要试剂与耗材超净工作台，CO2培养箱，台式低速离心机，酶标仪，生物倒置荧光显微镜，流式细胞仪(美国FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.3方法

1.3.1(MTT)法观察益肾固冲汤对MCF-7细胞增殖抑制作用取对数生长期MCF-7细胞，经消化、计数、配制成浓度为5×104个/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 μl细胞培养悬液(每孔5×103个细胞)，将细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。弃去培养基，磷酸缓冲液清洗2次，用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入200 μl相应含药培养基，同时设立阴性对照组，阳性对照组(加入不同浓度的益肾固冲汤2×10-1、2×10-2、2×10-3、2×10-4、2×10-5g/ml)。96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24、48、72 h。将96孔板进行MTT染色，λ=490 nm，测定OD值。计数各组别抑制率及药物IC50。实验组抑制率(%)=(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值×100%。应用SPSS17.0通过机率单位加权回归法计算IC50。

1.3.2流式细胞仪检测益肾固肾汤对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响随机分为空白对照组(不加药物组)、益肾固冲汤用药组(每孔加入低浓度2.5 μg/ml、中浓度10 μg/ml和高浓度40 μg/ml，用0.2%DMSO溶解)。孵育时间为24、48、72 h。之后对细胞进行细胞复苏、培养、传代。流式细胞仪(Annexin V/PI双染色法)检测益肾固冲汤对MCF-7细胞凋亡的影响。

1.3.3流式细胞仪检测益肾固冲汤对MCF-7细胞凋亡周期的影响随机分为阴性对照组(不加药物组)、益肾固冲汤用药组(每孔加入低浓度2.5 μg/ml、中浓度10 μg/ml和高浓度40 μg/ml，用0.2%DMSO溶解)。孵育时间为24、48、72 h。对细胞进行细胞复苏、培养、传代。将对数生长期的MCF-7细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。作用24、48、72 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集细胞。用磷酸缓冲液洗涤细胞一次(离心2 000 r/min，5 min)收集5×105细胞。制备的单细胞悬液用体积分数为70%乙醇固定2 h，4℃保存，染色前用磷酸缓冲液洗去固定液(细胞悬液用200目筛网过滤一次)。加100 μl RNaseA37℃水浴30 min。再加入400 μl碘化丙啶(PI)染色混匀，4℃避光30 min。上机检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。

2结果

2.1益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响随益肾固冲汤浓度的增高及用药时间的延长，对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制的作用逐渐增强。与阴性对照组相比，除剂量为2×10-5g/ml，作用时间24 h组无统计学意义外，其余各组均有统计学意义(P<0.05)。可见益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞增殖起到抑制作用，且具有明显的量效与时效关系。见表1。

组别(μg/ml)24hOD值(x±s)抑制率(%)48hOD值(x±s)抑制率(%)72hOD值(x±s)抑制率(%)对照组0.322±0.23122.350.362±0.0091)45.30.242±0.00673.42×10-5g/ml0.342±0.0163.850.591±0.0081)7.160.734±0.0111)20.682×10-4g/ml0.354±0.0071)9.750.576±0.0111)15.350.724±0.0121)33.282×10-3g/ml0.341±0.0101)13.790.563±0.0081)22.440.513±0.0071)41.342×10-2g/ml0.347±0.0091)16.130.492±0.0051)27.910.389±0.0051)54.622×10-1g/ml0.336±0.0041)18.690.459±0.0061)31.590.321±0.0101)66.21

与对照组比较：1)P<0.05

2.2益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响人乳腺癌MCF-7细胞经过不同浓度的益肾固冲汤处理24、24、72 h后，各组均呈现不同程度的凋亡，尤其中晚期细胞的凋亡趋势明显，总凋亡率随着剂量的增加、时间的延长而逐渐增高。在益肾固冲汤40 μg/ml、作用72 h后，诱导细胞凋亡能力最强，总凋亡率为73.5%。见图1。

图1　不同剂量益肾固冲汤作用24、48、72 h人乳腺癌 MCF-7细胞的总凋亡率

2.3益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞增殖周期的影响见表2。低、中、高浓度益肾固冲汤作用于人乳腺癌MCF-7细胞

表2益肾固冲汤对人乳腺癌MCF-7细胞增殖周期的影响(%)

时间组别G1SG2凋亡率24h阴性对照组54.626.7518.650秋水仙素2.5μg/ml54.1228.8916.990秋水仙素10μg/ml51.2327.8620.911.54秋水仙素40μg/ml47.8826.7925.333.9248h阴性对照组51.3530.3218.330秋水仙素2.5μg/ml46.3829.7823.845.11秋水仙素10μg/ml44.6928.4526.867.32秋水仙素40μg/ml43.5227.1629.327.0472h阴性对照组54.5927.9117.50秋水仙素2.5μg/ml44.6527.1328.225.35秋水仙素10μg/ml42.3925.9731.646.24秋水仙素40μg/ml34.6427.6137.7517.93

24、48、72 h后，以阴性对照组相比，G0/G1期细胞比率随作用时间延长、浓度的增加在逐渐减少；S期细胞比例基本不变；G2/M期的细胞比率随作用时间延长、浓度的增加在逐渐增多，细胞生长周期较明显的停滞在G2/M期，细胞G2/M期堆积，具有明显时间依赖性，益肾固冲汤40 μg/ml，作用72 h时，MCF-7细胞凋亡率最高，达17.93%。

3讨论

乳腺癌是一个世界范围内严重危害妇女健康的恶性肿瘤，其中老年乳腺癌的特点为临床分期晚、病理分级高、淋巴结转移多〔1〕。然而目前的乳腺癌治疗方案几乎都存在作用靶点单一，疗效不尽人意，毒副作用大等缺点，这些成为临床肿瘤治疗的瓶颈。我国传统的中药复方，有望成为突破这些瓶颈辅助的利器。采用中药复方对老年乳腺癌进行联合治疗，已被临床证明行之有效〔2，3〕。其机制在于中医强调从整体出发，调整机体阴阳、气血、脏腑功能的平衡，内治和外治相结合，根据不同的临床证候，采用辨证论治。事实表明，中医药能促进老年乳腺癌患者术后体质的恢复；减轻乳腺癌放化疗等辅助治疗所致的毒副反应；不同程度地缓解晚期乳腺癌患者的临床症状。这对改善患者的生存质量，提高生存率，降低复发率，都具有重要的临床意义和广泛的应用前景。

中医认为乳腺癌的主要病因和发病机制在于：肝气郁结、冲任失调、毒热蕴结、气血两虚。肝气郁结，肝经失于疏泄，气血奎滞，乳络不畅，则乳房结块；先天不足，或多产房劳，肝肾亏虚，冲任失养，致乳络不荣，则乳房肿块质硬；气火痰热，结聚肝胃二经，经脉疲滞，化生乳岩，毒热蕴结，致肿块破溃，则浸淫秽臭；乳岩日久，气血耗伤，则贫血消瘦，疼痛难忍，五脏俱衰。根据乳腺癌的临床演变及特点，中医专家认为其治疗上应以清热滋阴，补益肝肾为主。益肾固冲汤是依据中医传统理论组建的中药复方，由菟丝子、覆盆子、杜仲、川断、桑寄生、熟地、白芍、阿胶、党参、陈皮、甘草等11味中药组成。此方在临床进行了基于病症的疗效观察，表明其能够明显增加乳腺癌病人的5年存活率。

本实验显示益肾固冲汤对MCF-7细胞增殖具有抑制作用，都具有明显的时-效和量-效关系。通过益肾固冲汤对MCF-7细胞增殖影响的研究，发现益肾固冲汤对MCF-7有明显的抑制作用，为中药治疗乳腺癌奠定了理论依据。

中药能通过多种方式干扰肿瘤的生长、代谢、增殖等过程。通过流式细胞仪仪检测益肾固冲汤对MCF-7细胞的凋亡作用。结果显示益肾固冲汤能阻滞细胞周期，对DNA合成有抑制作用，对诱导细胞凋亡具有明显的量效、时效关系。且MCF-7细胞中晚期凋亡趋势明显。因此益肾固冲汤具有较好的抗肿瘤活性。

在益肾固冲汤对MCF-7细胞增殖周期的影响的实验中与阴性对照组相比，G0/G1期细胞比率随作用时间延长、浓度的增加在逐渐减少；S期细胞比例基本不变；G2/M期的细胞比率随作用时间延长、浓度的增加在逐渐增多，细胞生长周期较明显的停滞在G2/M期，细胞G2/M期堆积，具有明显时间依赖性。

综上所述，益肾固冲汤可以抑制MCF-7细胞的增殖，诱导细胞凋亡，具有明显的量效和时效关系，细胞的增殖抑制与诱导凋亡作用与G2/M期有关。

4参考文献

1隗立兵，康骅，海涛，等.老年乳腺癌 140 例的临床特点和治疗〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(15)：2858-60.

2孙燕.临床肿瘤内科手册〔M〕.第4版.北京：人民卫生出版社，2003：586-97.

3邹庆华，姜玉石，李凯.胸苷磷酸化酶的研究进展及其化疗效果间的关系〔J〕.中国肿瘤临床，2005;32(9)：535-53.

〔2013-09-13修回〕

(编辑袁左鸣)