活性元宫型药铜宫内节育器铜离子及药物体外释放的研究

侯丽，周越，辛玲，高娜娜，杜江，2，邵海浩，吴尚纯，王慧萍＊

（1.国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730；3.上海市计划生育科学研究所，上海 200032）

宫内节育器（IUD）是一种相对安全、长效、简便、经济、可逆、对性生活以及哺乳无影响的避孕措施，深受广大育龄妇女的欢迎。为了提高避孕效果，IUD 在材质、结构等方面进行了不断改进，发展至今，含铜IUD 成为目前国际公认的性能较理想的宫内节育器［1］。

含铜IUD 除了惰性支架引起机械性压迫和损伤外，铜离子（Cu2＋）释放引起的生物毒性常会导致盆腔炎、出血和疼痛等不良反应，成为影响含铜IUD 续用率的主要原因［2］。为解决这一问题，我国科研人员研制出以硅橡胶为载体、含吲哚美辛（IMC）的含铜含药IUD，此类IUD 能够在提高避孕效果的基础上，减少Cu2＋的“暴释现象”所带来的不良反应的发生。但由于药物含量、释放特性、材料设计和制作方法等不同因素，目前临床上常用的药铜IUD 存在着IMC释放不稳定或释放量少而达不到预期效果的问题［3］。所以本课题组对此类产品给予了进一步更新，采用理化性质更稳定、具有更高生物利用度的新型前列腺素合成酶抑制剂双氯芬酸钠（DFS），研制成了新型活性元宫型药铜IUD。

为避免体内实验的局限性，本研究以模拟宫腔液为释放介质，以含IMC 或DFS 的两种活性元宫型药铜为研究对象，采用体外模拟释放的方法检测Cu2＋浓度，比较IMC和DFS的体外释放规律，初步探索Cu2＋与药物的生物相容性关系，为改进此类节育器提供可靠的实验数据及途径。

材料与方法

一、研究材料

1.IUD：元宫药铜288型IUD（含20mg IMC，Cu 表 面 积288 mm2）和 元 宫 药 铜288 型IUD（含20mg DFS，Cu表面积288mm2）由上海市计划生育科学研究所提供。

2.仪器：电感耦合等离子体发射光谱仪（thermo 6300serial，Thermo，美国）；紫外／可见分光光度仪（岛津UV-2450，日本）；扫描电镜（岛津SS-550／S ERVO，日 本）和 恒 温 水 浴 振 荡 器（ZWY-110X30，上海智城）。

3.模拟宫腔液的配制：以模拟宫腔液作为释放介质，模拟宫腔液的成分如下［4］：NaCl 4.97g／L、KCl 0.224g／L、CaCl20.167g／L、NaHCO30.25g／L、葡萄糖0.50g／L、NaH2PO4·2H2O 0.072g／L。由于pH 值对铜的腐蚀很重要［5］，实验采取1mol／L的HCl溶液以及1mol／L 的NaOH 溶液调节模拟宫 腔 液pH 值 为7.0（人 体 宫 腔 液pH6.0～7.9）［6］。

4.标准品配制：Cu2＋储备液由定量稀释商品铜标准溶液（浓度：1000mg／L，中国计量科学研究院）得到。IMC和DFS标准品均购自中国药品生物制品检定所。IMC标准储备液（150mg／L）和DFS标准储备液（150mg／L）均用模拟宫腔液配制并稀释。所有溶液均用去离子溶液配制。

二、实验方法

1.绘制Cu2＋的标准曲线：将1 000mg／L 的铜储备液用1%的稀硝酸逐级稀释至0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg／L 的系列Cu2＋标准溶液，测定其吸光度值。铜标准曲线方程为y＝580.420x-3.164，x指吸光度值，y 为Cu2＋浓度。

2.绘制IMC 标准曲线：用模拟宫腔液配制IMC储备液，并稀释得到含IMC 0、1、2、4、5、8、10、12、15mg／L的系列标准溶液，用紫外分光光度仪进行紫外扫描，确定最大吸收波长，选择318nm 波长处测定标准溶液吸光度值，得出标准曲线方程。IMC标准曲线方程为y＝57.80153x-0.14364（R2＝0.99974），x指吸光度值，y为IMC浓度。

3.绘制DFS标准曲线：用模拟宫腔液配制DFS储备液，并稀释得到含DFS 0、10、14、16、20、25、30、40、50mg／L的系列标准溶液，用紫外分光光度仪进行紫外扫描，确定最大吸收波长，选择275nm波长处测定标准溶液吸光度值，得出标准曲线方程。DFS标准 曲 线 方 程 为y＝31.07521x-0.14445（R2＝0.99994），x指吸光度值，y为DFS浓度。

4.Cu2＋释放量测定：参考文献所述［7］，取2种型号元宫药铜宫内节育器各5 只分别浸入盛有50ml模拟宫腔液的锥形瓶中密封，然后置于（37±1）℃的恒温水浴振荡器中保持不同时间，前3d每天换液，随后的1周每2d换液，随后20d每4d换液，之后每周换液。收集更换下的液体，用电感耦合等离子体发射光谱法测定其吸收值，代入标准曲线，求得Cu2＋浓度。

5.IMC释放率测定：收集浸泡元宫药铜宫内节育器（带20 mg IMC）的液体，在318nm 波长处测定其吸收值，代入标准曲线方程y＝57.80153x-0.14364（R2＝0.99974），求 得 浓 度 值，计 算IMC含量。

6.DFS的释放率测定：收集浸泡元宫药铜宫内节育器（带20mg DFS）的液体，在275nm 波长处测定其吸收值，代入标准曲线方程y＝31.07521x-0.14445（R2＝0.99994），求 得 浓 度 值，计 算DFS含量。

7.宫内节育器表面形貌分析：在元宫药铜宫内节育器未浸泡前以及浸泡10、30、60d 后，取出样品，用去离子水冲洗干净，干燥后，用扫描电镜观察样品表面形貌。

三、统计学分析

结 果

一、Cu2＋释放量测定

结果显示：在初始阶段（前20d），2 种药铜IUDs的Cu2＋释放均较快且不平稳（Cu2＋的暴释现象）；前2～9d，元宫药铜IUD-DFS的Cu2＋每日释放量均大于元宫药铜IUD-IMC，且在3～7dCu2＋的每日释放量有显著差别（P＜0.05）；10～17d，元宫药铜IUD-DFS的Cu2＋每日释放量均小于元宫药铜IUD-IMC，且在14～17d但两者之间有显著性差异（P＜0.05）；第18天后2种药铜IUDs的释放量几乎相同（P＞0.05）（图1）；两组IUD的Cu2＋的累计释放量在前、后期差别不大，差值变化较小（P＞0.05），但在5～33d有显著差别（P＜0.05）（图2）。

二、DFS和IMC的每天释放量比较

DFS在释放介质中呈现双相释放：在前10d，药物释放较快，10～20d释放达到平衡，20d后基本达到稳态，此后DFS 每24h 平均释放量约为（0.134±0.025）mg（图3）。而IMC 在模拟宫腔液中的早期释放则呈不规则状态，前7d的释放量显著少于DFS（P＜0.05），8d后每天释放量又显著大于DFS（P＜0.05），20d后IMC的24h平均释放量约为（0.675±0.175）mg（图3）。

三、DFS和IMC的累计释放量比较

1～7dIMC的释放速率较慢，累计释放量显著小于DFS（P＜0.05），8d后释放较快，并在第9d与DFS趋同（P＞0.05），10d后超越了DFS的累计释放量（P＜0.05）（图4）。

图1 元宫药铜IUDs的Cu2＋每天释放量（n＝5）

图2 元宫药铜IUDs的Cu2＋累计释放量（n＝5）

图3 元宫药铜IUDs的DFS和IMC的每天释放量（n＝5）

图4 元宫药铜IUDs的DFS和IMC的累计释放量（n＝5）

四、元宫药铜释放后铜丝表面的形貌比较

扫描电镜观察样品表面形貌结果显示：浸泡前，两组IUD 铜套表面均基本光滑（图5A、B），可看到铜丝表面有略微的凹凸不平，存在拉痕，为自然的纯铜表面特征（图5a、b）。浸泡10d后，两组铜套表面均有较稀疏的浅的蚀坑（图5C、D），其 中 含IMC 的IUD 铜 丝 表 面 腐 蚀 程 度较重（图5c）。浸泡30d后，两组铜套表面有密集的较大的蚀坑（图5E、F），且两组铜丝的表面均出现了絮状沉淀（图5e、f）。浸泡60d后，两组铜套表面有大而深的蚀坑（图5G、H），可以看见蚀坑外和蚀坑内还存在很多颗粒，可能是表面沉积物和腐蚀产物，但IMC 组的沉积物更多（图5g、h）。对比两组药铜IUD 浸泡前和浸泡后的铜丝形貌（图5a和c、e、g，5b和d、f、h），可观察到随着浸泡时间的增加，两组铜丝的腐蚀程度均增加。

图5 浸入模拟宫腔液不同时间的药铜IUD 铜丝表面形貌

讨 论

由于含铜IUD 引起的经血量过多和疼痛主要与Cu2＋暴释导致的子宫局部前列腺素产生和释放有关，中国科研人员研制出含前列腺素合成酶抑制剂IMC和以医用高分子材料硅橡胶为载体的缓释系统，进而开发出具有这种缓释系统的含铜含药IUD。临床资料显示这类药铜IUD 的确能有效控制放置IUD 后早期月经血量的增多，减轻疼痛，因症取出率低［8］，给育龄妇女提供了一种很好的避孕选择，是IUD 的发展与进步。

但某些上市的药铜宫内节育器由于IMC 释放、IMC与材料的组织相容性等诸多因素，存在着质量不等、标准不一、释放不稳定等问题，直接影响到避孕安全，从而关系到育龄妇女的身心健康。因此，选择性质稳定的前列腺素合成酶抑制剂，研发安全、有效的新型药铜IUD 迫在眉睫。

众所周知，IMC 是一种非选择性非甾体类抗炎药，通过抑制环氧合酶（COX）影响花生四烯酸的代谢，使生理性、炎症性前列腺素（PG）的合成减少，局部炎症反应、组织的充血肿胀、对缓激肽等的疼痛敏感性都减轻，从而发挥其抗炎、镇痛作用，但不可避免的会影响机体的正常生理功能。研究表明，哺乳动物的COX 至少有2种同工酶COX-1和COX-2，他们催化的反应相同，但其产物的表达、功能和特性有明显的不同［9］。COX-1是结构酶，在大多数组织中都有表达，其催化生成的PGs参与维持机体的多种生理功能，如保护胃黏膜细胞、维持肾血流量、调节血小板功能等；COX-2是诱导型酶，多数组织内不表达，但在多种致炎因子刺激下，能在滑膜细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞中诱导表达［10］，表达水平可升高10倍～80倍，催化形成过量的病理性PGs，参与炎症反应，诱发疼痛［11］。因此选择性COX-2抑制剂比IMC等非选择性非甾体类抗炎药更能发挥抗炎、镇痛的作用［12］。

DFS，化学名称为2-［（2，6-二氯苯基）氨基］苯乙酸钠，为苯乙酸类衍生物，是选择性COX-2抑制剂。本药的作用机制是抑制炎症反应中的环氧合酶，对COX-2的抑制明显高于对COX-1的抑制，因此它的抗炎、镇痛作用明显强于阿司匹林、IMC 等药物。其特点是剂量小，起效快，不良反应少，且耐受性好，个体差异小，长期应用无蓄积作用［13］。近年来随着DFS研究的深入，其临床适应证也越来越多［14-16］。所以本课题对药铜IUD 给予了改善和更新，采用DFS研制成新型药铜IUD，与含IMC的药铜IUD 进行对照，比较两者的Cu2＋和药物释放规律。

由研究结果可知，两种药铜IUD 在浸泡初期均有严重的暴释现象，且释放不稳定，释放速率曲线为先上升再下降，反复几次，21d后释放趋于低浓度稳定，之后，2种药铜IUDs的每天释放速率和累计释放速率几乎相同。从而可推断2 种药铜IUDs Cu2＋释放规律几乎无差异。

对比两组药铜IUD，我们可以看到在浸泡初期，当DFS 的释放速率高时，含DFS 元宫药铜的Cu2＋的释放速率比含IMC 元宫药铜的释放速率高得多；当IMC的释放速率高时，含IMC 元宫药铜的Cu2＋的释放速率并不比含DFS元宫药铜低，两者几乎持平。这说明铜的腐蚀有可能加速了DFS的释放，Cu2＋的腐蚀速率越快，DFS 的释放量越大，而DFS的快速释放能够避免由于植入含铜IUD 产生Cu2＋的暴释而引起的不良反应。反过来，IMC的释放并未促进Cu2＋的释放，反而阻碍了Cu2＋的释放，这与以前的关于IMC 释放规律的研究报告并不一致［7，17］。

另外，当DFS释放恒定后，每24h平均释放量约为（0.134±0.025）mg，IMC 的24h平均释放量约为（0.675±0.175）mg，大约是DFS 的5 倍。因为DFS对COX-2的选择性抑制作用更强，DFS的抗炎镇痛作用比IMC强2～2.5倍，所以，尽管相同剂量的IMC-药铜IUD 和DFS-药铜IUD 的药物释放量有差异，但就临床疗效来说，两者作用可能相近；而且，因为局部用药且释放稳定，DFS的不良反应发生率明显低于IMC，耐受性也会好于后者。

从腐蚀形貌及Cu2＋释放曲线可以看出，铜丝由于表面存在着微裂纹，在浸入模拟宫腔液的初始阶段腐蚀速率很高，随着Cu2＋的释放，腐蚀产物沉积在表面，阻碍了腐蚀反应的进行，因此Cu2＋释放速率曲线先上升，再下降，后期释放速率趋于平缓。但IMC和DFS可能导致的铜丝腐蚀形貌及表面成分的差异还有待进一步的研究。

综上所述，DFS因释放稳定，不良反应少，耐受性好，个体差异小等优势有望取代IMC成为新型活性元宫型药铜的药物制剂，但其与载体材料的组织相容性、体内释放规律、远期生物安全性等问题还需要继续研究。

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