下调E2-EPF水平对宫颈癌Caski细胞生物学行为的影响

梁静，李琳，吴丽杰，凌斌，孙霭萍

（中日友好医院妇产科，北京 100029）

泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象，细胞内蛋白质泛素化降解是蛋白质重要的转录后修饰方式之一，泛素-蛋白酶体途径参与调节细胞周期进程、细胞增生与分化，以及信号传导等多种细胞生理过程［1］。泛素系统的紊乱与肿瘤的发生密切相关。

泛素结合酶E2-EPF（ubiquitin-conjugating enzyme E2-EPF）是E2泛素结合酶家族成员之一，在多种肿瘤组织中高表达［2-3］，无论是在常氧还是低氧情况下，都可以抑制抑癌基因von Hippel-Lindau［4］，稳定低氧诱导因子-1α（HIF-1α），启动HIF-1α下游反应链，从而促进肿瘤的生长和侵袭［5-7］。前期研究中我们发现，E2-EPF 在宫颈癌组织中呈高表达状态，其表达水平与临床分期和病理分级密切相关，并参与肿瘤细胞的增殖、侵袭等［8］。但有文献报道，在不同的宫颈癌细胞株中E2-EPF 的作用存在差异［9-10］。因此，我们再次通过siRNA 下调Caski细胞株中E2-EPF 的表达，研究其在细胞周期、细胞增殖以及放、化疗反应等方面的影响，探讨E2-EPF在宫颈癌中的作用。

资料和方法

一、材料

1.试剂：E2-EPF-siRNA 质粒、对照质粒及转染试剂盒、羊抗兔多克隆抗体（Santa Cruz，美国）；Isogen试剂（Nippon Gene，日本）；逆转录试剂盒、E2-EPF探针、GAPDH 探 针 及PCR 反 应 试 剂（Applied Biosystems，美 国）；M-PER 蛋 白 提 取 剂 及BCA 蛋白定量试剂盒（Pierce，美国）；蛋白酶抑制剂（Roche，美国）；E2-EPF C-term 抗体及β-actin抗体（ABGENT，美国）；RPMI 1640培养基、Opti-MEM低血清培养基（Gibco，美国）；MTT 细胞增殖实验试剂盒（Promega，美国）；Annexin V-FITC 凋亡试剂盒（武汉华美生物）。

2.细胞系来源及培养：人类宫颈癌细胞Caski（日本东京医科大学），培养于含有10% FBS 的RPMI-1640培养基中，37℃，5%CO2。

二、实验方法

1.细胞转染：收集对数期生长期的Caski细胞，按3×105／孔种于6 孔板中，培养于含有10%FBS的RPMI-1640培养基中，37℃，5%CO2。24h后，取100μl E2-EPF-siRNA（siRNA 组）和对照质粒（对照组），按说明分别进行瞬时转染。

2.实时荧光定量PCR：按说明提取两组细胞总RNA，以 波 长A260／280 进 行 定 量。取1 μg 总RNA 进行逆转录。E2-EPF 探针上游序列为：5’-C GACCTCCAGGTCACCAT-3’；下游序列为：5 ’-GGAACAGACCTCCAGCATATGG-3 ’。 以GAPDH作为内参，于StepOnePlus Real-time PCR system 中进行扩增，扩增条件是：95℃10min；95℃15s，50℃10s，60℃1min，40个循环。以StepOne software v2.0进行定量分析。

3.Western blot：将M-PER 蛋白提取液和蛋白酶抑制剂按50ml∶1片的比例制成混合液加于两组细胞沉淀中，于冰上裂解30min后，14 800 g 离心15min，取上清，BCA 试剂盒进行蛋白定量。两组细胞分别提取30μg总蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，一抗E2-EPF C-term浓度1∶250，4℃摇床孵育过夜，二抗浓度1∶500，室温摇床孵育30min。以β-actin为内参。

4.细胞周期检测：将两组细胞消化分离成单细胞悬液，离心收集细胞，以70%乙醇固定过夜。4ml PBS 洗 涤 细 胞 两 次，加 入 含 有100 μg／ml RNase A 的100μg／ml碘化丙啶染液，孵育30min。流式细胞仪分析细胞周期。

5.细胞增殖实验：将1×103Caski细胞接种于96孔板，6h后分别转染E2-EPF-siRNA 质粒和对照质粒，继续培养1～9d后，按说明进行MTT 实验，于酶标仪上测量570nm OD 值。每组设3个复孔，重复3次，取平均值。

6.放疗后细胞死亡与凋亡检测：取3×105的Caski细胞种于6孔板中，6h后分别转染E2-EPFsiRNA 质粒和对照质粒，于37℃，5%CO2培养24h后，将两组细胞分别经0Gy、4Gy、7Gy、10Gy 4个不同剂量X 线照射，继续培养24h、48h 和96h。取2×105细胞，PBS洗涤，400μl结合缓冲液悬浮后，加入5μl Annexin V-FITC，室温避光10 min，再加入5μl碘化丙啶，流式细胞仪检测细胞死亡和凋亡比例。每组设3复孔，重复3次，取平均值。

7.化疗药物实验：取2×104Caski细胞种于96孔板中，6h后分别转染E2-EPF-siRNA 质粒和对照质粒，37℃、5%CO2培养24h。加入不同浓度的顺铂（Cisplatin，5μmol／L、20μmol／L、40μmol／L），或紫杉醇（Taxol，10nmol／L、20nmol／L、50nmol／L），或 拓 扑 替 康（Topotecan，0.5nmol／L、1nmol／L、2nmol／L），或 依 托 铂 苷（Etoposide，0.5 μg／ml、5μg／ml、15μg／ml），24h后进行MTT 检测细胞相对数量。细胞存活率以加药组OD／未加药组OD×100%表示。不同药物剂量的两组细胞均行3复孔，重复3次实验，取平均值。

三、统计分析

结 果

一、siRNA 下调Caski细胞内E2-EPF水平

通过RNAi 技术下调Caski 细胞内源性E2-EPF水平，并分别通过Real-time PCR 和Western blot在mRNA 和蛋白水平上进行验证（图1）。

二、流式细胞周期检测及细胞增殖实验

下调E2-EPF水平后，细胞内G0-G1期细胞百分比显著增加；S和G2-M 期细胞总数比例减少（图2）；细胞的生长速率明显低于对照组，再次证实了E2-EPF参与Caski细胞生长的调节（图3）。

图1 Caski细胞株转染E2-EPF-siRNA 质粒后内源性E2-EPF的表达情况

图2 Caski细胞株转染E2-EPF-siRNA质粒后细胞周期检测

图3 Caski细胞株转染E2-EPF-siRNA质粒后细胞增殖MTT 实验

三、X 线放疗实验

经不同剂量（0Gy、4Gy、7Gy、10Gy）X 线照射后，未发现下调细胞内源性E2-EPF 对细胞死亡及凋亡的影响。两组细胞经照射后24h，细胞死亡与凋亡检测结果如图4。照射后48h及96h，两组间细胞死亡与凋亡也无明显差异（数据未显示）。

四、化疗药物实验

下调Caski细胞内源性E2-EPF水平对紫杉醇和顺铂的反应无明显作用，但能增强对Topotecan-拓扑异构酶I抑制剂和Etoposide-拓扑异构酶II抑制剂的敏感性（图5）。

图4 不同剂量放疗处理24h对于转染E2-EPF-siRNA质粒Caski细胞株的影响

图5 不同浓度Topotecan和Etoposide作用24h对两组细胞活率的影响

讨 论

近年陆续有报道，E2-EPF 在乳腺癌和食道癌组织中也参与肿瘤的生长和转移，但是对宫颈癌Hela细胞的生长作用结果不一［9-10］。前期研究已经证实E2-2PF 在宫颈鳞癌组织中呈高表达水平，其表达水平与临床分期和病理分级密切相关，为了进一步研究E2-EPF 在不同宫颈癌细胞株中的作用，本文再次针对Caski进行研究。利用RNAi瞬时转染技术，下调Caski细胞株内E2-EPF水平，可以调控细胞的生长周期，减缓细胞的生长速度。由此可见，E2-EPF参与Caski细胞周期的调控及细胞的增殖，对于肿瘤细胞的生长有重要的意义。

Topotecan作为拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂可以与拓扑异构酶I-DNA 三元复合物结合，从而阻碍断裂DNA 单链的重新连接，并影响拓扑异构酶I的再循环利用，使哺乳动物细胞无法有效地修复损伤的DNA 双链，最终导致细胞死亡［11-13］。细胞毒性作用主要作用于DNA 合成的S期，同样也作用于DNA损伤后的修复和基因表达过程［13］。由于拓扑异构酶I的浓度在增生期细胞中随整个细胞周期保持稳定，在静止期细胞中此酶也有表达，因此对增殖缓慢及耐药的实体瘤均有潜在作用［14］。本实验中，在0.5nmol／L、1nmol／L 和2nmol／L 三 个 浓 度 的Topotecan作用下，siRNA 组与对照组间均有显著差异。

Etoposide作用于DNA-拓扑异构酶II，形成药物-酶-DNA 复合物，阻碍DNA 修复造成DNA 链断裂，作用于哺乳动物细胞周期的G2期［15］。高浓度（≥10μg／ml）时，Etoposide使进入有丝分裂期的细胞溶解，而低浓度（0.3～10μg／ml）时，则抑制细胞进入有丝分裂的前期。本实验中，在0.5μg／ml、5 μg／ml和15μg／ml三个不同浓度下，下调E2-EPF使细胞对Etoposide的敏感性均显著增加，这一结果与其药理特性相吻合。

结合前期研究结果［8］，在宫颈鳞状细胞癌中，E2-EPF参与细胞周期的调控与细胞增殖，对肿瘤的生长有重要意义。下调细胞内源性E2-EPF，可以使HIF-1α蛋白水平下降，明显减弱细胞的增殖、侵袭和体外成瘤性，并可以增强细胞对拓扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂的敏感性。

【致谢】 本实验部分于日本东京医科大学產婦人科实验室完成，特别感谢井本惠一教授、西洋孝医师及樋熊千夏给予的支持及帮助。

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