气相色谱-质谱法同时快速测定血清中5 种剧毒灭鼠剂

黄会秋 ， 黄 逊， 余惊笋

（平阳县疾病预防控制中心，浙江 温州325400）

毒 鼠 强（tetramine）、氟 乙 酰 胺（fluoroacetamide）、氟乙酸钠（fluoroacetamide）、甘氟Ⅰ（1，3-二氟-2-丙醇，1，3-difluoro-2-propanol）与甘氟Ⅱ（1-氯-3-氟-2-丙醇，1-chloro-3-fluoro-2-propanol）是一类有机灭鼠剂，在我国曾被广泛用于灭鼠。这5 种灭鼠剂毒性强烈，且极易造成二次中毒，对人、畜的危害性很大，我国农业部第199 号公告（2002 年）中已明令禁止生产和使用。

毒鼠强化学名为四亚甲基二砜四氨，毒性比氰化钾强100 倍，是一种γ-氨基丁酸（GABA）的拮抗物，与神经元GABA 受体形成不可逆的结合，使氯通道和神经元丧失功能，尚未有确认的解毒剂，哺乳动物口服的LD50（半数致死剂量）为0.10 mg／kg；氟乙酰胺是一种具有接触、熏蒸和内吸收作用的有机氟灭鼠剂，对人致死量（经口）为23 mg／kg；甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ统称为甘氟（gliftor），属于有机氟灭鼠剂，是一种具有选择毒力的化合物，大鼠的口服LD50 为1.25 mg／kg。氟乙酰胺与甘氟在生物体内都可代谢氧化成毒性更大的氟乙酸。氟乙酸（fluoroacetic）及其钠盐，在体内与三磷酸腺苷和辅酶A作用形成氟乙酸辅酶A，再与柠檬酸作用形成氟柠檬酸，抑制乌头酸酶，使三羧酸循环受阻，损害神经系统，导致出现一系列的病理改变，对人致死量（经口）约为2 ～5 mg／kg［1］。

目前，甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ的检测报道［2］较少，毒鼠强、氟乙酰胺与氟乙酸（盐）的检测方法较多，主要是色谱［3-7］及色谱-质谱联用［8-12］等。这些方法一般只能同时检测这5 种物质中的1 ～2 种。关福玉等［13］采用添加微量三氯化铬和较常规提高3 倍灵敏度的核磁共振法，一次性测定生物样品中氟乙酸钠、氟乙酰胺、甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ，但检出限较高（mg／L 级），不适合血液内微量（μg／L 级或更低）残留检测。尚未见同时检测这5 种物质的方法报道。由于这5 种灭鼠剂都属于致痉挛性杀鼠剂，急性中毒时中毒症状较相似，为了抢救患者生命的需要，很有必要同时快速检测。

毒鼠强、氟乙酰胺、甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ可直接被有机溶剂萃取；而氟乙酸钠极性很强，易溶于水，不能从血清等极性基质中用有机溶剂直接萃取，这可能是未见同时检测这5 种物质的原因之一。本文探索用气相色谱-质谱联用法同时检测这5 种物质。首先须衍生氟乙酸钠以降低其极性，且衍生化过程不得影响其他4 种物质的提取。基于此，选择氟乙酸钠几种常用衍生化方法中的酰胺化方式［5］，在酸性环境下于血清中直接添加衍生剂N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐及催化剂N，N′-二环己基碳二亚胺，氟乙酸钠衍生物与毒鼠强、氟乙酰胺、甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ一并被乙酸乙酯萃取，经氮吹浓缩后用气相色谱-质谱测定。

另外，毒鼠强、氟乙酰胺、氟乙酸衍生物、甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ的沸点和极性差别很大，尤其是甘氟Ⅰ与萃取剂（如乙酸乙酯）的保留时间很接近，常规的非离子液体色谱柱都不易实现不分流模式下的分离。本法选用SLB-IL59 离子液体色谱柱，其具有出色的分离能力，可在15 min 内较好地分离5 种灭鼠剂。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-QP2010 Ultra 气相色谱-质谱联用仪（日本Shimadzu 公司）；5430R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公 司）；N-EVAP 氮 吹 仪（24 孔，美国Organomation 公司）；HY-2 往复振荡器、涡旋混匀器（金坛市富华仪器有限公司）。色谱柱：SLBIL59（固定液：1，12-二（三丙基磷）十二烷二（三氟甲基磺酰基）亚胺，美国Sigma-Aldrich 公司）。

N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐与N，N′-二环己基碳二亚胺均为分析纯（上海安谱公司）；乙酸乙酯、甲醇为HPLC 级（德国Merck 公司）；苯为色谱纯（天津四友公司）；盐酸为优级纯，氢氧化钠为分析纯（上海国药集团）；氯化钠为分析纯（上海国药集团），于550 ℃灼烧3 h 以上，干燥器中保存；实验用水电导率＜3 μS／cm；空白血清来自瑞安血站。

毒鼠强标准溶液（200 mg／L）购自中国疾病预防控制中心；氟乙酰胺（纯度97%）、氟乙酸钠（纯度99%）、甘氟Ⅰ（纯度97%）与甘氟Ⅱ（纯度96%）均购自德国Dr. Hielscher 公司，分别用甲醇配制成1 000 mg／L 的标准贮备溶液。临用时用乙酸乙酯稀释成各种单一或混合标准使用液。

1.2 样品前处理

吸取2.00 mL 血清，置于10 mL 具塞尖底刻度玻璃离心管（以下称离心管）中，分别加入100 μL N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐水溶液（100 g／L）和70 μL N，N′-二环己基碳二亚胺甲醇溶液（66 g／L），用盐酸溶液（1.0 mol／L）调pH 至2.0，混匀，室温振荡5 min（240 次／min）后，加入1.0 g 氯化钠与6.00 mL 乙酸乙酯，用力振摇2 min，以3 000 r／min（离心半径11.0 cm）离心5 min，吸取5.00 mL 上清液于50 ℃下氮吹近干，加入乙酸乙酯250 μL 并涡旋0.5 min，移至内嵌微量尖底衬管（250 μL）的进样瓶中，上机测定。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件 色谱柱：SLB-IL59（30 m×0.25 mm×0.20 μm，最高温度：300 ℃）；进样室温度：240 ℃；柱温程序：初始55 ℃，保持1 min，以100 ℃／min 升至150 ℃，再以30 ℃／min 升至240 ℃，保持15 min；载气：He 气，恒线速度：1.0 mL／min；进样体积：1.0 μL，不分流进样。

质谱条件 接口温度：240 ℃；电子轰击（EI）离子源温度：200 ℃；电子能量：70 eV；溶剂延迟时间：2.9 min；全扫描（Scan）模式定性：m／z 30 ～300；选择离子监测（SIM）模式定量。5 种灭鼠剂的分子结构式见图1，特征离子、定量离子及保留时间见表1。

图1 5 种灭鼠剂的分子结构图Fig.1 Molecular structures of the five rodenticides

表1 5 种灭鼠剂的保留时间、定量与特征离子Table 1 Retention times，quantitative and characteristic ions of the five rodenticides

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

选择Rtx-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、SLB-IL59（30 m×0.25 mm×0.20 μm）色谱柱进行分离比较试验。Rtx-5ms 与DB-17ms 可以在分流进样模式下将甘氟Ⅰ与萃取剂乙酸乙酯分离，但不分流进样模式下不易分离；DB-1701 无论在分流还是不分流进样模式下，都能较好地将甘氟Ⅰ与乙酸乙酯分离，但甘氟Ⅰ拖尾较严重；SLB-IL59 是离子液体色谱柱，其担体涂层离子液体呈现的强极性与高沸点特性，克服了传统色谱柱随极性增加，耐温极限下降的不足，极性较现有的非离子液体色谱柱更强，最高使用温度却较高（300 ℃）。方法选择SLB-IL59 色谱柱，不分流进样模式，采用恒线速度程序升温，经多次试验确定了1.3 节的色谱条件，15 min 内成功分离了5 种剧毒灭鼠剂，标准品选择离子色谱图见图2。

图2 5 种灭鼠剂的选择离子谱图Fig.2 Selected ion monitoring chromatograms of the five rodenticides

2.2 氟乙酸衍生条件的确定

2.2.1 衍生方法

氟乙酸（盐）相对分子质量小，极性很强，需衍生化以降低其极性，以便从血清中提取，并改善色谱分离与提高灵敏度。目前适用于气相色谱或气相色谱-质谱联用仪检测的衍生化模式主要有3 种：甲（乙）酯化［14］；用五氟苄基溴将氟乙酸衍生为氟乙酸五氟苄基酯［6］；酰胺化，用N，N′-二环己基碳二亚胺催化氟乙酸与N，N-二乙基对苯二胺，衍生化产物为N-（4-N′，N′-二乙氨基）苯基氟乙酰胺，用GCNPD （nitrogen phosphorus detector）［5］或 GCMS［15］测定。前二种衍生方式都需在无水环境下进行，长时间的萃取及较高温度的蒸干衍生过程易促使氟乙酰胺水解与甘氟挥发；而酰胺化衍生可以在水相中室温下进行，衍生时间也较短，利于直接衍生水性生物样品如血、尿中的氟乙酸（盐），不会影响氟乙酰胺与甘氟的提取。本方法采用酰胺化衍生化方法。

2.2.2 衍生pH

氟乙酸酰胺化衍生需在酸性条件下进行。加入衍生剂与催化剂后的血清溶液pH 约为2.3，分别用盐酸溶液（1.0 mol／L）与氢氧化钠溶液（0.5 mol／L）调节衍生液pH 至1.0、1.8、2.0、2.1、3.0、4.0、5.0、6.0，考察pH 对衍生反应的影响。如图3a所示，pH 2.0 的血清溶液中氟乙酸钠衍生物的质谱峰最高，确定衍生pH 条件为2.0。

2.2.3 衍生温度与时间

经试验，衍生反应速度很快，可在室温（10 ～30℃）下直接进行。由于催化剂N，N′-二环己基碳二亚胺不溶于血清，催化时以振荡为宜。萃取前分别振荡0、2、5、10、15、25 min。如图3b 所示，无须振荡仪，仅萃取时手工振荡2 min，衍生反应已基本完成；仪器振荡2 min 后氟乙酸衍生物的峰高已至最高，为保证衍生反应充分选择5 min 为衍生化时间。

2.2.4 衍生剂体积

实验中分别向2.00 mL 空白血清中加入10、30、50、70、100、150、200 μL N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐溶液（100 g／L）与70 μL N，N′-二环己基碳二亚胺甲醇溶液（66 g／L）。如图3c 所示，随着N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐溶液的添加量增加，氟乙?酸钠衍生物的峰高也随之增高；至100 μL 为最高。确定100 μL 为N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐溶液（100 g／L）的添加量。

2.2.5 催化剂体积

实验中分别向2.00 mL 空白血清中加入10、30、50、70、100、200 μL N，N′-二环己基碳二亚胺甲醇溶液（66 g／L）与100 μL N，N-二乙基对苯二胺硫酸盐溶液（100 g／L）。如图3d 所示，随着N，N′-二环己基碳二亚胺甲醇溶液的添加量增加，氟乙酸钠衍生物的峰高也随之增高；30 μL 时已近平衡；至70 μL 为最高。确定70 μL 为N，N′-二环己基碳二亚胺甲醇溶液（66 g／L）的添加量。

2.3 萃取条件的优化

2.3.1 萃取剂的种类

在气相色谱与气相色谱-质谱方法中，对毒鼠强、氟乙酰胺、氟乙酸钠衍生物、甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ的提取，苯与乙酸乙酯［16］是最常用的2 种萃取剂。比较了二者对5 种目标物的提取效果。如表2 所示，苯对毒鼠强、氟乙酰胺、氟乙酸钠衍生物的萃取率要略高于乙酸乙酯，但对甘氟Ⅰ与甘氟Ⅱ的萃取率要低于乙酸乙酯。另外，苯较乙酸乙酯不易与甘氟Ⅰ在不分流状态下分离，且毒性较大。因此选择乙酸乙酯为萃取剂。

表2 乙酸乙酯与苯萃取血清中5 种灭鼠剂的萃取率Table 2 Extraction rates of the five rodenticides from serum with ethyl acetate and benzene

2.3.2 萃取剂的体积

在液液萃取操作实践中，为了提高回收率，降低检出限，分析工作者常常采用先少量多次萃取后氮吹浓缩的操作。实验显示，新鲜血清与乙酸乙酯二相界面有一约1 mm 乳化层（血清越不新鲜，乳化越严重，因此宜在一天内完成样本检测），不适宜“少量多次”每次吸净上清液的操作。本实验采用一次性大剂量萃取，取大部分上清液氮吹浓缩至小体积，并通过基质校准曲线消除基质对回收率的影响。经试验，确定萃取剂添加量为6.00 mL，吸取5.00 mL上清液，氮吹浓缩至0.25 mL，辅以250 μL 微量尖底衬管，既加快处理速度，又得到较高的浓缩倍数。

2.3.3 氯化钠的用量

实验中分别向2.00 mL 空白血清中加入0、0.3、0.7、1.0、2.0 g 氯化钠，考察了盐析效应对目标物的提取作用。如表3 所示，随着氯化钠添加量的上升，甘氟Ⅰ、甘氟Ⅱ与氟乙酰胺的提取率上升较快，氟乙酸钠衍生物与毒鼠强上升较小，但都至血清层饱和时最大。因此选择略超饱和量的1.0 g 氯化钠添加量。

表3 氯化钠添加量对5 种灭鼠剂萃取率的影响Table 3 Effect of the sodium chloride amount on the extraction rates of the five rodenticides

2.4 线性关系与检出限

向6 支已加入2.00 mL 空白血清的10 mL 离心管中分别添加适量标准溶液，配制0、0.010、0.020、0.050、0.100、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0 mg／L的混合标准使用液，按1.2 节样品前处理方法处理并进行测定，以各目标物的色谱峰峰高Y 对其质量浓度X（mg／L）进行线性回归。结果显示方法线性良好，相关系数R2＞0.995；氟乙酰胺的线性范围为0.02 ～2.0 mg／L，毒鼠强为0.02 ～10 mg／L，其他分析物为0.01 ～1.0 mg／L；检出限为0.001 ～0.002 mg／L（S／N＝3）（详见表4）。与文献［8-12］等报道的方法相比，本文所建立的方法灵敏度更高或相当，加之5 种剧毒灭鼠剂可同时检测的优势，使得本方法具有更广泛的适用性。

表4 5 种灭鼠剂的线性方程、相关系数（R2）、线性范围和检出限Table 4 Regression equations，correlation coefficients （R2），linear ranges and LODs of the five rodenticides

2.5 加标回收率与精密度

取空白血清，分别添加高、中、低3 个水平的标准溶液，静置2 h 以使目标物与血清基体相互作用至平衡状态，然后进行测定，每个水平平行测定6次。如表5 所示，各目标物的回收率介于84.0% 和110.0%之间，相对标准偏差（n ＝6）介于2.9% 和7.5%之间。

表5 5 种灭鼠剂的加标回收率与相对标准偏差（n＝6）Table 5 Recoveries and relative standard deviations of the five rodenticides （n＝6）

3 结论

本文采用衍生条件简单、温和的酰胺化方式衍生血清中的氟乙酸盐，衍生物与其他目标灭鼠剂一并被乙酸乙酯一次性大剂量萃取，高倍浓缩，采用SIM 模式成功地建立了气相色谱-质谱联用方法，实现了准确定性、定量测定5 种剧毒灭鼠剂。方法快速且检出限较低，作为一种重要的技术储备，将应用在日后的卫生应急检测中。

［1］ Liu J Q，Li X M. Chinese Journal of Vector Biology and Control（刘吉起，李新民. 中国媒介生物学及控制杂志），2004，15（2）：148

［2］ Huang H Q. Chinese Journal of Health Laboratory Technology（黄会秋. 中国卫生检验杂志），2013，23（15）：3040

［3］ Chen J M，Wang S Y，Qin Y X. Chinese Journal of Health Laboratory Technology （陈京闽，王生英，秦迎旭. 中国卫生检验杂志），2014，24（18）：2626

［4］ Li Y X，Lin D，Wang X Q，et al. Physical Testing and Chemical Analysis Part B：Chemical Analysis（李艳霞，林丹，王贤亲，等.理化检验：化学分册），2008，44（7）：640

［5］ Guan F Y，Liu L，Luo Y. Environmental Chemistry （关福玉，刘力，罗毅. 环境化学），1995，14（3）：196

［6］ Li Y，Yang Z Y，Ma Z P，et al. Forensic Science and Technology （利越，杨召雨，马治平，等. 刑事技术），2009（6）：27

［7］ Hu P Q，Huang H C，Xiong M. Journal of Environment and Health （胡培勤，黄辉春，熊敏. 环境与健康杂志），2011，28（6）：542

［8］ Chen B，Liu H L，Rong W G，et al. Chinese Journal of Food Hygiene （陈蓓，刘华良，荣维广，等. 中国食品卫生杂志），2012，24（6）：539

［9］ Rong W G，Liu H L，Chen B，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （荣维广，刘华良，陈蓓，等. 分析试验室），2013，32（1）：73

［10］ Zhang J，Lu L B，Yang Y，et al. Journal of Food Safety and Quality （张晶，卢丽彬，杨奕，等. 食品安全质量检测学报），2013，4（3）：660

［11］ Ping X H，Gao Y，Yi P. Chinese Journal of Health Laboratory Technology （平小红，高岩，伊萍. 中国卫生检验杂志），2014，24（11）：1565

［12］ Yuan R，Zou Y J. Capital Journal of Public Health （袁蕊，邹艳杰. 首都公共卫生），2014，8（5）：224

［13］ Guan F Y，Miao Z C，Liu Y T，et al. Military Medical Sciences（关福玉，缪振春，刘荫棠，等. 军事医学科学院院刊），1997，21（2）：116

［14］ Liu X P. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （刘宪平.药物分析杂志），2006，26（7）：978

［15］ Song M，Jia W，Qian D P. Chinese Journal of Health Laboratory Technology （宋鸣，贾薇，钱大鹏. 中国卫生检验杂志），2005，15（12）：1476

［16］ Lou B B，Xu L M，Hong P. Chinese Journal of Health Laboratory Technology （楼冰冰，徐陆妹，洪萍. 中国卫生检验杂志），2008，18（9）：1770