液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的25 种喹诺酮类药物

林 黎， 张 毅 ， 涂小珂， 谢丽琪， 岳振峰， 康海宁， 吴卫东， 罗 耀

（深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，深圳市食品安全检测技术研发重点实验室，广东 深圳518045）

喹诺酮类药物（quinolones，QNs）是一类合成抗菌药物，对革兰氏杆菌和其他耐药抗生素的细菌具有良好的抗菌作用，具有抗菌谱广、吸收好、给药方便、价格低廉等特点，在临床治疗感染方面有较广泛应用［1-4］。但当喹诺酮类化合物违规添加到化妆品中，散布于人体皮肤表面，尤其是脸部、口唇等皮肤比较柔嫩，黏膜血管丰富的部位表面，则可能通过微血管和黏膜被快速吸收，逐渐破坏皮肤表面的正常菌群，导致皮疹、速发性过敏等不良反应。因此喹诺酮类药物在我国的化妆品卫生规范中属于严禁添加的药物［5］。但是受到见效快、成本低的利益驱使，在祛痘、除螨、抗粉刺的化妆品中违禁添加喹诺酮类药物的案例仍不时出现，有些不法厂商甚至采取添加少量多种的办法逃避监管。随着人们生活水平的日益提高，化妆品已成为必不可少的消费品之一，其安全性已成为广大消费者日益关注的问题。因此建立一个针对化妆品中多种类喹诺酮类药物同时检测的方法十分必要。

目前，国内外对食品中喹诺酮类药物残留的检测研究较多，也较为成熟。检测方法多为高效液相色谱法［6，7］、液相色谱-质谱联用法［8-19］、酶联免疫法［20］等，对于化妆品中喹诺酮类药物的分析研究较少，有的仅关注其中几种喹诺酮类药物［21，22］，难以适应化妆品安全监管的需要。化妆品根据用途和功效不同，基质差异也较大，其主要成分有植物油脂、动物油脂、脂肪醇类、粉质原料、表面活性剂和防腐剂等，若违禁添加抗生素，则添加含量通常在万分之一到百万分之一范围。检测化妆品中多种喹诺酮类药物，不仅要求样品提取和净化方法要具有普适性和高效性，还要求检测方法具有良好的选择性和灵敏度。

本文建立了以溶剂提取、正己烷除脂结合液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS／MS）同时检测水、乳、霜类化妆品中25 种喹诺酮类药物的分析方法。方法的前处理过程有机溶剂用量少、处理通量大，能有效去除样品中油脂、表面活性剂和粉类杂质的干扰，其分离效果、选择性和重现性均良好，各项性能指标满足残留检测的要求。

1 实验部分

1.1 仪器试剂

API 5000 液相色谱-质谱联用仪（美国AB 公司），配有电喷雾离子源；氮吹浓缩仪（美国ZYMARK 公司）；低温离心机（德国Sigma 公司）；超声波水浴机（德国Elmasonic 公司）；涡旋混合器（中国MS2 Minishaker）；Poroshell C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国Agilent 公司）。

喹诺酮类标准品：纯度均大于98% （德国Dr.Ehrenstorfer 公司或者Fluka 公司提供）。正己烷、乙腈、甲醇、甲酸、乙酸（HPLC 级，德国默克公司）；氯化钠（分析纯，含量≥99.5%，天津市福晨化学试剂厂）；乙腈溶液（含0.2% 甲酸）；0.1% 甲酸水溶液；乙腈-0.1% 甲酸水溶液（1 ∶9，体积比）；微孔滤膜（0.22 μm，有机相型）；水为二次蒸馏水。

样品：水、乳液、霜类化妆品样本均购于本地商场。样品使用前混合均匀。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量标准品，以甲醇稀释、定容。对难溶于甲醇的标准品，先加少量甲酸溶解，再以甲醇定容。标准储备溶液于-30 ℃冰箱中保存。准确移取各个化合物的储备液于容量瓶中，用甲醇稀释配制成混合标准溶液，于-30 ℃避光保存。基质匹配工作曲线以基质空白提取液稀释混合标准溶液，配制成不同浓度的混合标准工作液。

1.3 样品前处理

乳液和霜类样品：称取1.0 g 样品（精确至0.01 g）置于50 mL 具塞离心管中，加入2 g 氯化钠和10 mL 0.2%甲酸的乙腈溶液，高速旋涡振荡3 min，常温超声分散15 min，以9 500 r／min 离心5 min，取全部上清液移至另一离心管。剩余残渣再准确加入10 mL 0.2%甲酸的乙腈，重复提取一次后合并上清液，旋涡混匀。准确吸取1 mL 上述提取液，40 ℃氮吹近干，用乙腈-0.1% 甲酸溶液（1 ∶9，体积比）定容至5 mL，再加入5 mL 正己烷溶液，混匀，9 500 r／min 离心5 min，弃去上层正己烷，将下层提取液以有机滤膜过滤，滤液供LC-ESI-MS／MS 测定。

水类样品：称取1.0 g 均匀样品，置于50 mL 具塞离心管中，加入8 mL 含0.2% 甲酸的乙腈溶液，涡旋振荡，超声提取15 min，9 500 r／min 离心5 min，取上清液。残渣再加入8 mL 含0.2% 甲酸的乙腈，重复上述提取过程一次，9 500 r／min 离心5 min 后合并上清液，用含0.2% 甲酸的乙腈定容至20 mL，混匀。准确吸取1 mL 上述提取液，40 ℃氮吹近干，用乙腈-0.1% 甲酸溶液定容至5 mL，过0.22 μm 有机滤膜，滤液供LC-ESI-MS／MS 测定。

1.4 液相色谱-串联质谱条件

色谱条件 Poroshell C18色谱柱；流动相A 为含0.1%甲酸的水，B 为含0.1% 甲酸的乙腈；梯度洗脱程序：0 ～6 min，87% A ～10% A；6 ～9 min，10% A；9 ～9.1 min，10%A ～87%A；9.1 ～15 min，87% A。流速：250 μL／min。柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。

质谱条件 正离子电喷雾离子化（ESI＋），单位分辨率，喷雾电压为4 500 V，碰撞气为氮气，碰撞气压力为41.4 kPa，气帘气压力为448.3 kPa，雾化气压力为448.5 kPa，去溶剂气压力为276 kPa，离子源温度为450 ℃。各化合物的监测离子对（Q1／Q3）、去簇电压（DP）、碰撞能（CE）以及碰撞室出口电压（CXP）等质谱参数见表1，在各个化合物保留时间前后各90 s 采集该化合物的两个离子通道信号。

表1 25 种喹诺酮类药物的主要质谱参数和保留时间Table 1 MS parameters and retention times for the analysis of the 25 quinolones

表1 （续）Table 1 （Continued）

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

图1 提取溶剂对25 种喹诺酮类药物回收率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on recoveries of the 25 quinolones

已有研究报道主要以动物源样品中喹诺酮类药物残留为主，较少涉及化妆品中该类药物的检测［14，15］。化妆品中喹诺酮类药物分析有以下特殊性：一方面，化妆品中含有大量油脂、糖、表面活性剂，违规添加喹诺酮类药物的含量通常在百万分之一至万分之一，因此要求前处理方法提取率要高、共萃取物尽可能少；另一方面，喹诺酮分子结构中既有羧基又有氨基官能团，即具有两性化合物的特性，对提取溶剂和方法具有较高要求［16，17］。实验比较了乙腈、甲醇、二氯甲烷、甲醇＋沉淀剂（乙酸锌＋亚铁氰化钾）等作为提取溶液的提取效果。结果如图1所示，甲醇对于大部分喹诺酮类药物的提取回收率为45% ～85%，对蛋白质沉淀效果不佳且共萃取物较多；二氯甲烷提取出现了乳化现象；甲醇＋沉淀剂尽管去除蛋白效果较好，但部分药物的提取回收率低于60%。乙腈沉淀蛋白效果最好，25 种喹诺酮类药物回收率为75% ～115%，因此选择乙腈为样品提取溶剂。根据喹诺酮类药物的酸碱性特点，实验还比较了乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈和0.2%乙酸乙腈的提取结果，结果表明酸性乙腈对大部分喹诺酮类药物的提取效果较好，加入甲酸或乙酸没有明显的差异，为了离子化环境尽量与流动相一致，选择0.2%甲酸乙腈作为后续实验的提取溶剂。

2.2 提取净化方法的优化

实验对比了超声水浴、涡旋振荡和水平振荡提取水、乳和霜类样品的效果。乳液或霜类化妆品的黏度较大，超声的空化作用使得样品更易于均匀分散，提取效果优于水平或涡旋振荡提取的效果，回收率较满意。在样品净化部分，曾尝试将乙腈提取液浓缩后重新以缓冲溶液溶解，HLB 固相萃取小柱净化，所得喹诺酮类药物的回收率为30% ～70%，其原因可能是部分化合物在固定相上保留不佳。实验改为无需固相萃取柱，而先以氮吹浓缩提取液，再以正己烷萃取进而除去脂溶性杂质，所有目标物的回收率为71% ～117%，满足检测需求。

2.3 样品基质效应

化妆品基质比较复杂，分析物共流出组分直接影响电喷雾离子化效果与检测信号的增强或抑制。为消除基质效应对目标化合物测定的影响，以空白样品提取液作为标准溶液的稀释液，用于对目标化合物进行定性和定量分析，这样方法采用的标准溶液和样品溶液都具有相似的离子化环境，从而确保方法的灵敏度和重现性。

2.4 质谱测定条件的优化

首先采用50 μg／L 的喹诺酮混合标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子，然后分别以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子。以多反应监测（MRM）正离子模式优化25 种化合物的质谱参数，具体如表1 所示。

2.5 线性关系、回收率、精密度和定量限

以峰面积为纵坐标y，各化合物的含量为横坐标x，建立标准曲线，3 种化妆品基质中25 种喹诺酮类化合物的线性关系均良好，其中保湿水样品基质中25 种喹诺酮类化合物的线性方程和相关系数见表2，线性范围为1 ～200 mg／kg。采用标准添加法，选择水、乳液、霜类化妆品空白样品，分别添加1、5、10 mg／kg 3 个水平的喹诺酮混合标准溶液，每个加标水平平行测定6 次，回收率及精密度数据见表2，平均回收率范围为87.4% ～105%，方法的相对标准偏差为4.54% ～19.7%。本方法的定量限为1.0 mg／kg。由MRM 谱图（图略）可以看出，所有目标化合物的色谱峰峰形对称、无明显干扰峰、检测灵敏度好。

表2 样品中25 种喹诺酮类药物的线性方程、相关系数、回收率和精密度（n＝6）Table 2 Linear equations，correlation coefficients （r），recoveries and precisions （RSDs）for the 25 quinolones spiked in sample （n＝6）

表2 （续）Table 2 （Continued）

3 结论

本研究测定的分析物为国内外普遍禁止在化妆品中添加的抗生素喹诺酮类药物，不仅要求分析方法能同时测定数十种喹诺酮类药物，同时需要具有良好的灵敏度和准确性。本文以酸化乙腈提取、正己烷净化，结合液相色谱-电喷雾电离串联质谱检测，建立了化妆品中25 种喹诺酮类药物的分析方法。实验优化了影响回收率和重现性的主要因素，所建立的方法快速、简便、重现性好、结果准确。该方法为化妆品中喹诺酮类禁用药物的监控和管理提供了高效、可靠的技术支持。

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