在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D3 和E

张艳海， 其布勒哈斯， 金 燕* ， 王 佳， 马文丽

（1. 赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海201206；2. 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古 呼和浩特001150）

维生素A（vitamin A（VA），retinol）、维生素D（vitamin D2（VD2）和vitamin D3（VD3））、维生素E（vitamin E（VE），tocopherol）是机体维持正常代谢和机能所必需的脂溶性维生素。维生素A 又称为视黄醇，具有促进机体生长、维持表皮完整等功能。维生素D 主要包括维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇），对哺乳动物具有促进钙磷代谢及成骨作用。维生素E 又称为生育酚，由于母生育酚环上甲基取代的变化有8 种活性形式，包括α、β、γ、δ-生育酚等。其中α-生育酚因为活性最高，具有抗氧化、抗衰老等作用，在食品科学中通常被单独考虑［1］。婴幼儿及成人配方乳品和动物饲料是脂溶性维生素强化的两种重要形式。目前对以上产品中维生素D 的分析主要存在以下3 个难点：一是维生素D 对温度、光照、氧气和极端pH 值较敏感，一般经过包被制成水分散微粒，再添加到食品基质中［2，3］，所以在前处理中往往需要将维生素D 从基质中释放出来；二是食品基质成分复杂，一般含有脂肪、乳化剂、蛋白质、甾醇等，另外还有甘油三酯、类胡萝卜素、类固醇和磷脂等与目标物极性类似的化合物，因此样品前处理一般需要净化过程；三是维生素D 在样品中含量低，尤其在母乳和牛奶中含量极低［4］，因此对检测方法的灵敏度要求较高。基于以上难点，一般的样品前处理方法中常包含皂化破壁、有机溶剂萃取、浓缩和净化等步骤［5-7］，尤其是我国［5］和欧洲［8］关于食品中维生素D 的现行标准分析方法，需采用正相制备色谱、反相分析色谱两套仪器，分别进行净化制备和分析，前处理过程极其繁琐，大大影响样品的分析效率。而结合多种分离机理的多维色谱分离模式，可以提高色谱系统的分离能力，扩大分离空间，增加色谱峰容量，减少色谱峰重叠［9］。在多维色谱分离手段中最常见的二维色谱分离技术已被越来越多地应用到食品分析中［10，11］。

本文采用在线二维液相色谱法（2D-LC）测定婴幼儿和成人配方乳品中的维生素A、D3和E，其中一维和二维分离均基于反相色谱。样品经过皂化、萃取后，直接进样分析，一次进样即可在线完成样品中维生素A、D3和E 的定量，提高了方法的准确性和样品的分析效率。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料

双三元液相色谱（DGLC）系统（Thermo Fisher，USA），配置包括6 通道真空脱气机SRD3600、双梯度分析型色谱泵（DGP3600）、自动进样器（WPS3000TSL）、二极管阵列检测器（DAD3000）、柱温箱（TCC-3000，配有一个2 位置六通阀和一个2 位置10 通阀）、Acclaim 120 C8 色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）和Accucore Polar Premium 色谱柱（C18 柱）（150 mm×3.0 mm，2.6 μm）、变色龙色谱管理软件（Chromeleon 7.2 SR1）。

维生素D3（纯度≥95%，HPLC 级）和维生素D2（纯度≥95%，HPLC 级）均由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；维生素A（all-trans retinol，纯度＞95%）购自Acros Organics 公司；维生素E（纯度≥96%，HPLC 级）购自Sigma 公司。KOH（分析纯）和抗坏血酸（纯度≥95%，分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（色谱级）购自Fisher 公司；去离子水（18.2 MΩ·cm）由Millipore 纯水机制得；婴幼儿配方奶粉和液态乳品由蒙牛乳业提供。

1.2 样品制备

参考国家标准方法（GB 5413.9-2010）［5］，精密称取奶粉10 g（液态奶50 g）于250 mL 锥形瓶中，加入30 mL 热水溶解（液态奶不需加入）后，再依次加入100 mL 15 g／L 的维生素C 乙醇溶液、25 mL 1.25 kg／L KOH 溶液和1.0 mL 10 mg／L 维生素D2内标溶液，磁力搅拌45 min，温度53 ℃。之后将皂化液转移至500 mL 分液漏斗中，以石油醚萃取3次，每次用100 mL 石油醚，然后用水洗涤3 ～5 次合并后的萃取液至中性（pH 试纸测试），收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水干燥。最后低温减压回收石油醚至萃取液剩余1 ～2 mL 时转移至10 mL 棕色瓶中，氮气吹干，以3 ～5 mL 甲醇溶解后转移至10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容，摇匀，放入4 ℃冰箱中保存待用。

1.3 标准溶液的配制

以甲醇溶解维生素A、D2、D3和E 标准品制成4 种维生素的混合标准储备液，质量浓度分别为1.24、1.00、1.00 和2.06 g／L。再用甲醇将上述混合标准储备液稀释100 倍后备用。

1.4 仪器条件

DGLC 系统的左泵作为一维分析泵，以C8 柱为一维分析柱，梯度洗脱，流速0.4 mL／min；以DGLC 的右泵作为二维分析泵，以C18 柱为二维分析柱，梯度洗脱，流速0.5 mL／min，柱温30 ℃，流动相均为乙腈（A）、甲醇（B）和水（C）；检测波长分别设为263 nm （维生素D3）、296 nm （维生素E）和325 nm （维生素A）；进样体积10 μL；收集定量环（loop 环）的体积为500 μL。系统流路连接见图1，梯度洗脱程序及阀切换时间见表1 和表2。

图1 全自动在线二维柱切换系统流路示意图Fig.1 Flow scheme of fully-automated online two-dimensional column switching system

表1 一维分离和二维分离的梯度洗脱程序Table 1 Gradient programs of the two-dimensional separation

表2 阀切换时间及过程Table 2 Times and processes of valve switching

2 结果与讨论

2.1 系统流路的构建

本文在前期研究［12］中，建立了婴幼儿配方奶粉中维生素A、D3和E 的全自动二维分离系统，但该方法存在以下缺点：一是由于一维和二维色谱柱的串联，在将目标馏分从一维色谱柱直接转移至二维色谱柱时系统压力会骤然升高，对色谱柱造成损伤；二是每次分析都需校正维生素D3在一维色谱中的保留时间，以重新确认切割时间窗口，否则会造成目标物在切割过程中损失。针对以上问题，本文对系统流路进行了优化：首先采用500 μL 定量环收集一维目标馏分，避免切换过程中系统压力的骤然变化；另一方面在定量环中预先填充高比例水相的溶剂，可以稀释一维分离中的流动相，减少了溶剂效应。二是将二极管阵列检测器置于收集馏分的定量环之前，这样可根据维生素D3在一维色谱柱中的出峰时间随时调整切割时间窗口，保证目标物能100%地从一维色谱柱切割至二维色谱柱中。如图2 所示，0 ～20 min 为一维分离过程，其中高浓度的维生素D3（5.0 mg／L）出峰时间窗口仅为0.3 min，为保证目标物全部切割至二维色谱柱中，将时间适当调宽为15.75 ～16.20 min，切割时间窗口为0.45 min。另外，可以根据保留时间的变化，灵活设定右阀的切换时间，以保证目标物在切割过程中无损失。优化后的系统流路可实现在第一维色谱柱上进行维生素A 和E 的定量及维生素D3的净化，在第二维色谱柱上进行维生素D3的定量分析。整个过程在密闭系统内自动化完成。

2.2 二维色谱条件的优化

一维分离机理和二维分离机理保持最大差异性或正交性是构建良好二维分离体系的关键。在我国现行标准方法中，正相色谱的分离净化结合反相色谱的定量分析，是正交性较好的“离线二维”分离过程，但实现正相色谱和反相色谱在线二维分离十分困难。目前多采用微柱［13，14］或在线蒸发接口技术［15］，虽然可解决溶剂兼容性问题，并减小正相色谱流动相对反相分离的溶剂效应，但对于常规样品的检测分析，还不具有普遍实用性。因此本文在一维和二维分离中均采用以疏水保留为主的反相色谱分离模式，一维为C8 柱，二维为极性嵌合的反相色谱柱，根据Snyder 等［16］的疏水减法模型，两根色谱柱的正交因子（Fs）为65，满足正交分离的条件，可作为正交色谱柱使用。由于C8 柱对脂溶性物质的保留较C18 柱弱，因此一维分析可以选择洗脱能力相对“较弱”的流动相，即可将维生素D3从一维转移至二维色谱柱中，从而减少溶剂效应的影响；另外，在色谱柱规格选择上，一维分离选择窄径柱有助于“压缩”谱峰，减小目标馏分的洗脱体积，从而减小溶剂效应。

图2 为4 种维生素混合标准溶液的二维分离图。从0 ～20 min 的一维谱图可以看出，维生素A和E 分离较好，可满足测定要求，说明C8 柱可以兼顾维生素A 和E 的分离；另外，维生素D2和D3在一维C8 色谱柱中未被分离，二者保留时间相同，被“压缩”成了一个峰，因此缩小了一维的切割时间窗口，这样既减小了对二维分离的溶剂效应，又可避免过多基质成分因窗口过大切割进入二维色谱柱中而造成干扰；在20 ～30 min 的二维分离中，维生素D3的色谱峰对称因子为1.05，对称性较好，维生素D2和D3的分离度为2.16，达到了基线分离。另取婴幼儿配方奶粉样品，按照1.2 节方法制备样品溶液，进样分析。从图3 婴幼儿配方奶粉样品分离谱图可以看出，4 种维生素分离较好，其中维生素D3色谱峰在峰顶点、前沿和后沿50% 处的紫外吸收光谱图较均匀一致，可判断维生素D3 色谱峰的纯度较好，样品基质无干扰，方法专属性较好。

2.3 维生素D 定量方法的选择

GB 5413.9-2010［5］采用外标法测定婴幼儿配方营养品中维生素D 的含量，由于维生素D 的绝对回收率较低，需要用回收率对每批的测定结果进行校正。但在实际分析中，每个样品的回收率不可能一致，因此会导致最终的测定结果重现性较差。本文参考欧洲食品标准［8］，采用内标法定量。维生素D2和D3是维生素D 的主要活性化合物，二者均为开环甾体类化合物，结构相似，理化性质相近，因此可互为内标物。另外，本文采用反相色谱法分离，可以将维生素D2和D3基线分离，维生素D2可以校正样品在皂化及萃取等前处理过程中维生素D3的损失，提高方法的准确度。从图4 可以看出维生素D2和D3在二维色谱柱中分离较好，且没有样品基质干扰，表明了内标法的可行性。

图3 婴幼儿配方奶粉样品中4 种维生素的（a）二维分析谱图和（b）20 ～30 min 的二维分离放大图谱Fig.3 （a）Two-dimensional chromatograms and （b）the second dimensional enlarged chromatograms from 20 to 30 min of the four vitamins in an infant formula sample

图4 （a）VD2 和VD3 混合标准溶液、（b）加VD2 内标的样品溶液和（c）未加VD2 的样品溶液的谱图Fig.4 Chromatograms of （a）a mixed standard solution of VD2 and VD3，（b）a sample solution spiked with VD2 as internal standard and （c）a sample solution without VD2

2.4 线性关系、精密度和定量限

分别精密量取维生素D3、A 和E 的混合标准溶液适量，置于不同的10 mL 棕色量瓶中，配成系列浓度的混合标准溶液，再分别精密加入1.0 mL 质量浓度为10 mg／L 的维生素D2作内标，进样10 μL。以质量浓度为横坐标，维生素D3与维生素D2的峰面积比值为纵坐标，维生素A 和E 均以峰面积为纵坐标，做线性回归。结果发现，维生素D3在0.02 ～5.0 mg／L 范围内的相关系数r 为0.999 6，维生素A 在0.62 ～124 mg／L 范围内的相关系数r为0.999 1，维生素E 在0.824 ～1 030 mg／L 范围内的相关系数r 为0.997 8，表明各目标物线性关系良好。按S／N ＝10 确定目标物的定量限，维生素D3的定量限为0.015 mg／L，维生素的定量限为0.040 mg／L；维生素E 的定量限为0.339 mg／L。

取0.1 mg／L 的混合标准溶液连续进样6 次，计算得到维生素D3、A 和E 峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.0%、0.93% 和1.01%。结果表明该方法在连续进样时精密度较好。

2.5 回收率

精密称取婴幼儿配方奶粉和液态奶样品，其中固体样品每份10 g，液体样品50 g，分别加入适量的维生素A、维生素D3和维生素E 标准品（见表3 和表4），按照1.2 节所述方法制备样品溶液，测定3种维生素的含量，计算回收率。结果显示，维生素D3的加标回收率为75.50% ～85.00%。维生素A的加标回收率为91.2% ～103.7%；维生素E 的加标回收率为89.2% ～95.6%。

表3 婴幼儿配方奶粉样品中维生素A 和E 的加标回收率（n＝3）Table 3 Recoveries of vitamins A and E spiked in a infant formula sample （n＝3）

2.6 实际样品测定及与标准方法比较

采用本法随机测定了婴幼儿、学生、中老年配方奶粉，奶酪和酸奶等强化乳品中维生素A、D3和E的含量，并与我国现行标准分析方法（GB 5413.9-2010）［5］的测定结果进行对比，结果见表5，其中维生素D3的对比结果见图5。采用配对t 检验法对数据结果进行了统计学分析，t 检验表明差异无统计学意义，可认为两种方法对维生素A、D3和E 的测定结果基本一致。

表4 样品中维生素D3 的含量及其加标回收率（n＝3）Table 4 Contents and spiked recoveries of vitamin D3 in samples （n＝3）

图5 采用本法与标准方法（GB 5413.9-2010）测定样品中维生素D3 含量的结果对比Fig.5 Result comparison of vitamin D3 in samples using this method and the standard method （GB 5413.9-2010）

表5 两种方法测定样品中维生素A 和E 的含量Table 5 Contents of vitamins A and E in different samples with the two methods

3 结论

本文基于在线二维液相色谱分离技术建立了快速、同时测定婴幼儿配方乳品、强化乳品中维生素A、D3和E 的分析方法。本文采用新的系统连接方式，减小了一维流动相对二维分离所造成的溶剂效应，避免了切换过程中系统压力骤升对分析柱造成的损伤，并且可随时根据目标物在一维色谱柱的出峰起止时间，灵活调整切割时间窗口大小，避免目标物在切换过程中的损失。另外，一维和二维色谱柱良好的二维正交性改善了系统的分离能力。最后，通过将本方法与GB 5413.9-2010 标准方法比较，采用配对t 检验分析，表明两种方法的测定结果差异无统计学意义。本方法简便、快速，自动化程度高，重现性好，方法回收率高，因此可作为配方奶粉或其他乳品中维生素A、D3和E 的测定方法推广应用。

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