应用动态顶空吸附-气相色谱-质谱法分析算盘子花气味的化学成分

黄代红， 张振国， 陈国平， 李后魂， 石福臣

（南开大学生命科学学院，天津300071）

大戟科（Phyllanthaceae）叶下珠族（Phyllantheae）大部分植物都必须依赖种特异性传粉（雌性）头细蛾（Epicephala）专门为其传粉，并且在雌花内产卵，双方形成专性传粉互利共生关系［1-5］。花气味在此关系中起着关键作用：可介导传粉者找到宿主植物，促使两者相遇［6］。目前关于大戟科植物-头细蛾互利共生体系中花气味方面的报道较少，仅限于算盘子属少数植物以及黑面神属植物小叶黑面神中［7，8］。

花气味是由植物花器官释放的一类低相对分子质量、低沸点、低极性以及具有挥发性的次生代谢物质［9］。在以往测定挥发物的研究中，通常采用传统的收集方法，如溶剂抽提和水蒸气蒸馏提取法［10］。这些技术操作存在对植物样品的机械损伤及温度变化，导致挥发物的提取液中包含了大量不挥发性物质，影响其真实性。因此，所获得的提取物很难代表植物在正常生理状态下的挥发物组成［11］。目前，挥发物收集的方法主要采用动态顶空吸附法（dynamic headspace adsorption），它因具备活体植株取样、操作便捷、对色谱柱的伤害较小等优点［12］，不仅被广泛应用 于 植 物 花 气 味 的 收 集［13］，如 榕 树［14-16］、百合［17］、桂花［18］以及木兰［19］等，而且也常用来收集其他物质中的挥发物，如小麦中的风味物质［20］、人工牛黄中的残留溶剂［21］以及保健食品中的挥发物［22］等。

算盘子（Glochidion puberum）隶属于大戟科（Phyllanthaceae）算 盘 子 属（Glochidion），直 立 灌木，生于海拔300 ～2 200 米山坡、溪旁灌木丛或林缘。花期4 ～8 月，果期7 ～11 月，在我国主要分布于南方省区［23］。目前主要集中于算盘子与头细蛾专性互利共生关系方面的研究［24］，至今还未见算盘子花气味成分分析的报道。本研究采用动态顶空吸附法收集算盘子花气味，运用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析其化学成分，为算盘子-传粉头细蛾互利共生关系的化学生态学方面的研究提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HP6890 （GC）-5975 （MS）型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；聚氟乙烯采集袋（2 L，Teflon®FEP），大连德霖气体包装有限公司；微型空气泵（FAY4002，6 L），成都气海机电制造有限公司；活性炭管（外径6 mm，长75 mm），Tenax TA 吸附管（100 mg／50 mg，60／80 目；外径6 mm，长75 mm），美国Sigma-Aldrich 公司；玻璃转子流量计（LZB-4），天津流量仪表有限公司；无味特氟隆管（PTEE），瑞典VICI Jour 公司；棕色进样瓶（2 mL），美国Agilent 公司；正己烷，色谱纯，美国Fisher 公司；丙酮，优级纯，天津试剂公司。

1.2 材料

本研究顶空样品野外收集于2013 年5 月上旬，供试植株为中国科学院昆明植物研究所百草园内栽培的算盘子，采集盛花期的雌花和雄花各约200 朵。

1.3 算盘子花气味收集

采用动态顶空吸附法收集算盘子花气味［25］，主要工作流程为：将采集好的花放入无味透明的聚氟乙烯采集袋中。首先，将通气泵产生的空气经过活性炭管净化，主要目的是除掉空气中的水分以及灰尘，以免影响后续吸附剂对花气味挥发物的吸附效果，由采集袋进气口通入袋内，模拟自然状态花气味挥发；然后，用抽气泵将花挥发的气味经由采集袋出气口导入填充有Tenax TA 吸附剂的玻璃管中，进行吸附收集。通气端和进气端空气流速均由玻璃转子流量计调节控制，为400 mL／min。收集装置中所有器件均用无味的特氟隆管连接。采样时间：晚上6 ∶30 ～11 ∶30，收集5 h。用空气作为对照，与花气味采集同步进行。

采集完毕后，用保鲜膜密封吸附管，然后用锡箔纸包裹并装入自封袋，置于超低温冰盒带回实验室。用2 mL 正己烷洗脱吸附管，收集0.5 mL 含有花气味的洗脱液于2 mL 棕色进样瓶内。氮吹浓缩至100 μL。最后将样品置于-18 ℃冰箱保存，直至进行仪器分析时取出。

1.4 气相色谱条件

在Okamoto 等研究［7］的基础上对气相色谱条件进行了优化。色谱柱：HP-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent，美国）；程序升温：40 ℃保持5 min，之后以3 ℃／min 升温至100 ℃，最后以5 ℃／min 升至200 ℃，保持5 min；进样量2 μL，采用分流模式，分流比2 ∶1；进样口温度250 ℃；载气为高纯He，流速1.0 mL／min。

1.5 质谱条件

电离方式EI；质量扫描范围m／z 35 ～450；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃。

1.6 花气味化合物定性与半定量

花气味化学成分的鉴定首先利用仪器自带的标准谱库（NIST08）进行检索，对于谱库检索结果物质单一，且匹配度高的峰，直接根据检索结果给予确认；然而，对于一些检索结果中出现两种及以上物质的峰，进一步在NIST 化学数据库网站（http：／／webbook. nist. gov／chemistry）上查询这些物质的保留指数，根据保留指数大小，最后加以确定。运用离子流峰面积归一化法计算花气味各挥发物组分的相对含量。

1.7 数据分析

所有数据均表示为平均值±标准差。利用单因素方差分析中的Tukey’s 方法检验花气味不同类型挥发物相对含量之间的差异性。数据分析和图片制作均用Graphad Prism 5. 0 软件完成。

2 结果与分析

2.1 算盘子花气味动态顶空吸附-GC-MS 总离子流图

花气味是植物长期进化的产物，在传粉过程中起到了吸引传粉者的关键作用［26］。目前，动态顶空吸附-GC-MS 技术广泛应用在植物与昆虫的关系研究中，运用此技术已分析鉴定出了小叶黑面神［8］、鸡嗉子榕［14］花气味的化学成分，并且通过电生理以及昆虫行为学实验筛选出了吸引各自传粉者的化合物：小叶黑面神花中2-苯乙醇和2-苯乙腈，即具有电生理活性，而且两者混合物也能够吸引传粉头细蛾［8］；鸡嗉子榕果挥发物中对苯甲基醚可以强烈地吸引榕小蜂［14］。因此，这种方法可信度高，收集的挥发物中包含了植物花真实的化学信息，可以为后续开展昆虫学实验提供可信的数据。本研究也采用动态顶空吸附-GC-MS 对算盘子花气味成分进行分析，获得其总离子流图（见图1），扣除空气中杂质峰后，共分离得到47 个峰，可以认为此47 个峰几乎代表了自然状态下算盘子花挥发的全部挥发物。

图1 算盘子花气味的动态顶空吸附-GC-MS 总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of the floral scent components in G. puberum using gas chromatography-mass spectrometry with dynamic headspace

2.2 算盘子花气味成分的GC-MS 分析

采用仪器自带谱库，运用计算机检索，结合人工解析各个峰对应的质谱图，从算盘子花气味中共鉴定出45 种化合物（见表1），相对含量超过1% 的只有11 种，占总含量的92.33%，分别是：顺-丁酸-3-己烯酯、反-β-罗勒烯、反-氧化芳樟醇（呋喃型）、芳樟醇、β-榄香烯、γ-芹子烯、大根香叶烯D、β-芹子烯、α-芹子烯、β-人参烯和苯乙腈。在这45 种挥发物中，有超过40 种的化合物广泛存在于其他一些植物花中［27］。因此，与同科植物小叶黑面神以及其他5 种算盘子植物一样［7，8］，算盘子花气味的化学组成也是通过常见的化合物来体现的。

表1 运用GC-MS 分析算盘子花气味成分的相对含量Table 1 Relative contents of the floral scent components of G. puberum using gas chromatography-mass spectrometry

表1 （续）Table 1 （Continued）

芳樟醇（38.06±3.36）% 和β-榄香烯（23.84±0.07）%两种物质在算盘子花气味中含量最高，总共占相对含量的61.9% （见表1），是算盘子花气味的主要成分，与已报道的5 种算盘子植物相比，它们的花气味主要成分之间存在明显的差异［7］。小叶黑面神花中2-苯乙醇和2-苯乙腈含量最高，超过80%，昆虫学实验证明，这两种物质具有很强的电生理活性，两者混合物能够强烈吸引小叶黑面神头细蛾［8］；因此，推测芳樟醇和β-榄香烯两种含量很高的挥发物也可能是吸引算盘子头细蛾的活性物质。对于此推测还需要进一步进行头细蛾电生理以及昆虫行为学试验来验证。

2.3 算盘子花气味中不同类型挥发物的比较

目前，通过现代提取技术从1 000 种植物花中已分离到1 720 种挥发性有机化合物［27］。通常分为3 大类：（1）脂肪族衍生物，通过脂肪酸途径合成；（2）单萜和倍半萜类化合物，主要通过异戊二烯途径合成；（3）苯环类芳香族化合物，通过莽草酸途径合成［28］。在算盘子花气味中，单萜类和倍半萜类物质相对含量最高，分别为（44.6±2.06）% 和（49.6±2.46）%，显著高于脂肪族衍生物（2.71±0.45）%和芳香族化合物（2.91±0.06）%。

大戟科叶下珠族算盘子属、黑面神属植物与头细蛾之间都存在专性传粉育幼互利共生关系［2-5］。同本研究一样，Okamoto 等［7］发现另外5 种算盘子属植物花气味也主要以萜类物质为主，尤其是单萜类物质。然而，Svensson 等［8］研究表明小叶黑面神花气味中芳香族化合物相对含量最高［7］。尽管与传粉头细蛾相关的叶下珠族植物种类繁多，但现已分析鉴定出花气味成分的植物种类有限，就目前研究结果的对比分析可以看出，与头细蛾相关的叶下珠族不同属间植物花气味化合物类别组成存在明显的差异，主要原因可能是黑面神属和算盘子属植物在叶下珠族植物发育系统中分别属于不同的独立的进化枝系［29］，导致它们的花气味在进化过程中同样分化出属于本属特定的、区别于其他属的化合物类别，同时也推测此类特定的化合物包含了其专门与种特异性传粉头细蛾进行化学交流的主要物质。

3 结论

采用动态顶空-GC-MS 技术分析算盘子花气味化学成分，结果发现芳樟醇（38.06%）和β-榄香烯（23.84%）这两种物质含量最高，推测可能是吸引传粉头细蛾的重要气味成分。本研究为进一步开展触角电生理检测和生物行为试验来筛选吸引传粉头细蛾的活性物质提供了理论依据。

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