超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品级聚苯乙烯和聚乙烯色母粒中33 种初级芳香胺

满正印， 王全林 ， 李和生， 张爱芝， 沈 坚

（1. 宁波大学海洋学院，浙江 宁波315211；2. 宁波市产品质量监督检验研究院，浙江 宁波315048）

初级芳香胺（PAAs）是一种毒性较强的致癌物质，可通过皮肤、胃肠道和呼吸道进入人体，如果长期接触会出现恶心、咳嗽、头痛、呕吐、失眠、溶血性贫血等症状，严重者可导致输尿管癌、肾癌、膀胱癌等恶性疾病。为此，欧洲议会和欧洲联盟委员会在其公布的2002／61／EC 与2003／3／EC 指令中，规定了多种特定芳香胺为受限制的危险物质，并且禁止销售能产生禁用芳香胺的商品［1］。我国政府也将芳香胺类化合物列为环境重点污染物，并对纺织品［2］、食品接触材料［3］、卷烟［4］、染料产品［5］等商品中PAAs 的限量或迁移量测定制定了相应的标准。食品级色母粒是指用于食品接触塑料着色的颜色添加剂，其可以在保持颜料化学稳定性和颜色稳定性的同时，使颜料在塑料中有更好的分散性，因此是食品接触塑料生产过程中不可或缺的原材料。色母粒是生产加工有色餐具的主要原料，但色母粒自身的颜料或助剂会释放出多种PAAs，并随着食品接触塑料的生产而发生转移，进而迁移到食品之中危害人体健康。而我国还没有关于色母粒中PAAs 的检测标准和检测方法，使得该类产品的监管处于空白状态。

目前关于PAAs 的检测方法主要有离子色谱法［6］、液 相 色 谱 法［2，3，6-9］、气 相 色 谱-串 联 质 谱法［4，5，10-14］和液相色谱-串联质谱法［1，15-21］。在这些方法中，离子色谱法和液相色谱法只通过目标物的保留时间定性，容易造成假阳性；气相色谱-串联质谱法与液相色谱-串联质谱法的分离检测原理相似，可以同时进行定性和定量分析，但气相色谱-串联质谱法需要较高的分离温度，无法准确检测热稳定性差的PAAs，限制了其检测PAAs 的种类。上述方法主要集中应用在纺织品、环境、食品接触材料、染料、电器等方面，由于基质差异，所建立的PAAs 检测方法不能直接应用于食品级色母粒中PAAs 的检测。另外，食品接触材料中PAAs 检测方法多是检测PAAs 的迁移量，主要是从食品接触材料安全性的角度保障食品安全。而本文从溯源的角度出发，选择最常用的聚苯乙烯（PS）色母粒和聚乙烯（PE）色母粒，采用同位素内标法，建立了食品级色母粒中33种游离PAAs 多组分同时测定的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）检测方法，不仅可以保障食品安全，还可以填补色母粒行业的监管空白。对实际样品的检测获得了满意的结果，说明本方法具有重要的实际应用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY／Quattro Premier XE 超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters 公司）；液氮冷冻粉碎机（A11 basic，德国IKA 公司）；旋转蒸发仪（R-210，瑞士BUCHI 公司）；高速离心机（TG16-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；超声波水浴锅（KS-300EI，宁波海曙科生超声设备公司）；氮吹仪（DC-12，上海安谱仪器公司）。甲醇（色谱纯，Merck 公司），甲酸（色谱纯，Acros Organics 公司），其他试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水（Millipore 公司超纯水器制备，电阻率为18.2 MΩ·cm）。33 种PAAs 标准品和3 种氘代PAAs 内标物（纯度大于98%，Dr. Ehrenstorfer 公司）见表1。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制：分别称取33 种PAAs标准品和3 种氘代内标物10. 0 mg，用甲醇溶解后转移至10 mL 棕色容量瓶中，以甲醇定容，得1 g／L 标准储备液。其中苯胺（ANL）标准储备液于-18 ℃保存，其他标准储备液于4 ℃保存。混合标准工作溶液的配制：以10% （v／v）甲醇水溶液配制不同质量浓度的PAAs 混合标准工作液，每一标准工作液中3 种氘代内标物的质量浓度均为50 mg／L。

1.3 样品前处理方法

PS 色母粒：称取1 g 样品（精确到0.01 g）于50 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL 二氯甲烷，超声提取15 min，待色母粒溶解，加入甲醇10 mL，摇匀使色母粒基质沉淀，以8 000 r／min 离心5min，取上清液于离心管中待用。用5 mL 甲醇润洗石墨化碳固相萃取柱，待润洗快结束时取上清液过柱，并开始用鸡心瓶收集流出液，最后用15 mL 甲醇洗脱，将收集的所有留出液在150 MPa、35 ℃条件下旋转蒸发至近干（约2 mL），将鸡心瓶中的溶液转移至10 mL 离心管中，并用2 mL 甲醇清洗鸡心瓶，合并清洗液于离心管中，用氮气40 ℃缓慢吹至约0.2 mL，10%（v／v）甲醇水溶液定容至2 mL，涡旋1 min，过0.22 μm 滤膜于衬管中，待测。

表1 PAAs 的CAS 号、保留时间及质谱参数Table 1 CAS Nos.，retention times and MS parameters for PAAs

PE 色母粒：称取冷冻粉碎至2 mm 粒径以下的样品1 g（精确到0.01 g），用滤纸包好后放于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 二氯甲烷，超声提取15 min，将提取液转移至装有10 mL 甲醇的鸡心瓶中，再用10 mL 二氯甲烷重复提取2 次，合并3 次提取液，在180 MPa、35 ℃条件下旋转蒸发至近干（约2 mL），将鸡心瓶中的溶液转移至10 mL 离心管中，并用2 mL 甲醇清洗鸡心瓶，合并清洗液于离心管中，用氮气40 ℃缓慢吹至约0.2 mL，以10% （v／v）甲醇水溶液定容至2 mL，涡旋1 min，过0.22 μm 滤膜于衬管中，待测。

1.4 UPLC-MS／MS 分析条件

色谱条件 色谱柱：BEH Phenyl 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱 温：40 ℃；流 速：0.20 mL／min；样品温度：20 ℃；进样体积：10 μL。流动相A 为含0.07% （v／v）甲酸的甲醇溶液，流动相B为水。流动相梯度洗脱程序：0 ～5 min，10% A；5～7.5 min，10%A ～55%A；7.5 ～12.5 min，55%A～85% A；12.5 ～13 min，85% A ～10% A；13 ～16.5 min，10%A。

质谱条件 离子源：电喷雾电离正离子（ESI＋）扫描；毛细管电压：3.00 kV；射频透镜1 （RF lens 1）和射频透镜2 （RF lens 2）的电压分别为15.0 V 和13.0 V；离子源温度：100 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气流量：600 L／h。采用多反应监测模式，优化后的采集参数见表1。采取多通道选择离子方式，通道1 选择PAAs 为间苯二胺（m-PDA）、1，5-二氨基萘（DANP）、对-氯苯胺（4-CA）、间氯苯胺（3-CA）、邻氨基偶氮甲苯（o-ANT）、4-氯-邻-甲苯胺（4-COT）、4-氨基联苯-d9（4-ABP-d9）、4-氨基联苯（4-ABP）、2-氨基联苯（2-ABP）、4，4′-亚甲基双（2-氯苯胺）、（4，4′-M-B-2-CA），通道2 为2，6-二氨基甲苯（2，6-TDA）、2，4-甲苯二胺（2，4-TDA）、对甲氧基苯胺（p-ASD）、邻氨基苯甲醚（o-ASD）、4，4′-二氨基二苯醚（4，4′-ODA）、4，4′-亚 甲 基 二 苯 胺（4，4′-MDA）、邻联甲苯胺（o-TLD）、4，4′-亚甲基-二-邻-甲苯胺（4，4′-MDOT）、2-氨基-5-硝基苯胺（2-M-5-NT），通道3 为2，4-DAA、对甲苯胺（p-TOL）、邻甲苯胺（o-TOL）、2，6 -二甲基苯胺（2，6-DMA）、2，4-二甲基苯胺（2，4-DMA）、2-萘胺（2-NAP）、3，3′-二氯联苯胺（3，3′-DCB）、4，4′-二氨基二苯硫醚（4，4′-THOA）、邻甲苯胺-d9（o-TOL-d9），通道4 为ANL、联苯胺（BNZ）、2-甲氧基-5-甲基苯胺（2-M-5-MA）、3，3′-二甲氧基联苯胺（3，3′-DMB）、2，4，5′-三甲基苯胺（2，4，5′-TMA）、3，4-二氯苯胺（3，4-DCA）、3，5-二氯苯胺（3，5-DCA）、苯胺-d5（ANL-d5）。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的优化

食品级色母粒根据基质的不同，可分为可溶性色母粒和不溶性色母粒。在提取色母粒中的PAAs时，应根据这两种不同的基质特性选择不同的提取方法。针对可溶性色母粒，由于其基质可以被相应溶剂溶解而使其中的PAAs 充分溶解到溶剂中，因此目前多使用溶解沉淀法。参考文献［17］选择ANL、o-TOL 和4-ABP 3 种具有代表性的目标物制备了PS 色母粒阳性样品。选择甲醇作沉淀剂，比较了丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷等溶剂对PS 色母粒的溶解效果和提取效果，发现二氯甲烷和三氯甲烷可以在有效溶解PS 色母粒的同时，有效提取其中的PAAs。考虑到两种溶剂的毒性，本实验选择二氯甲烷作为溶剂。另外，考察了以二氯甲烷做溶剂时超声提取时间分别为5、10、15 和20 min 对PAAs 提取率的影响，发现阳性样品中ANL 和4-ABP 的测量值在提取时间为10 min 时开始趋于平衡，而o-TOL则是在15 min 开始趋于平衡，因此最终选择使用二氯甲烷溶剂，提取时间为15 min。

针对不溶性色母粒，虽然没有有效的溶剂使其溶解，但可以选择合适的溶剂和合适的方法使其基质发生溶胀，进而提高基质中PAAs 的提取效率。PE 色母粒属于不溶性色母粒，我们选择常用的PE塑料溶胀剂二氯甲烷、二甲苯和环己烷，比较了PE色母粒的溶胀效果，发现二氯甲烷对PE 色母粒的溶胀效果较好，可有效提取PE 色母粒中的PAAs。本试验采用超声提取法，比较了超声提取次数对PAAs 提取效果的影响，结果如图1 所示。在提取次数为3 次时3 种PAAs 的检测含量最大，而大于3 次时测得值随着次数的增加而减小。造成这种现象的原因可能是洗脱剂含量的增加使洗脱液在涡旋过程中的时间变长，由此造成了目标物的损失。

图1 不同提取次数对PE 色母粒的提取效果的影响Fig.1 Effects of different extraction times on the PE masterbatch extraction

2.2 浓缩、净化条件的优化

2.2.1 浓缩方式的选择

目前常用的浓缩方法主要有旋转蒸发法和氮气吹干法，而PAAs 是一类易挥发性物质，样品在浓缩过程中应当十分小心，如果在旋转蒸发或氮气吹干过程中操作不当，将会造成PAAs 的严重损失。为解决这一问题，有的文献［1，17］中采用浓缩前加HCl溶液，定容前用NaOH 溶液中和的方法，但强酸强碱中和后生成的盐对仪器的伤害较大，不宜在本方法中实施。本试验采用将旋转蒸发浓缩液氮吹至近干的方法，在实验过程中先将样液旋转蒸发至约2 mL，再将浓缩液用氮气吹干至约0.2 mL，同样可以保证PAAs 在浓缩过程中不发生严重损失。但在实验中发现，用10% （v／v）甲醇溶液定容后溶液会变成乳浊液，造成这种现象的原因可能是溶液中的水和未吹干的有机浓缩液因不溶而发生乳化现象，因此样品在定容后需要用0.22 μm 滤膜缓慢过滤至衬管中。

2.2.2 固相萃取条件的优化

可溶性色母粒在溶于相应的溶剂后，其中的颜色、添加剂等杂质也会溶在溶剂中，因此对于可溶性色母粒的前处理，需要采用固相萃取的方式进行净化。目前用于萃取塑料中PAAs 的固相萃取柱主要是石墨化碳固相萃取柱，该柱可以有效吸附基质中残留的颜色、添加剂等杂质。参考固相萃取法的建立步骤，用甲醇清洗残留在石墨化碳小柱中的目标物，比较了加入甲醇的量对阳性样品中3 种目标物回收率的影响。检测结果显示，3 种目标物的回收率在洗脱剂用量为15 mL 时达到最大值，回收率在82.4% ～93.8%之间；而当洗脱剂的用量大于15 mL时，目标物的回收率逐渐降低，造成这种现象的原因同样可能是洗脱剂用量的增加，使得洗脱液在旋转蒸发过程中的时间变长，从而造成了目标物的损失。

2.3 超高效液相色谱-质谱条件的优化

2.3.1 流动相的选择

本试验比较了甲醇＋水、乙腈＋水以及甲醇和乙腈不同配比＋水等流动相体系对PAAs 的分离效果，发现乙腈在苯基柱中的洗脱能力强于甲醇。另外，在流动相中加入甲酸，一方面增强了部分PAAs 的信号强度，另一方面还增加了流动相的洗脱能力，缩短了PAAs 的保留时间。为保证PAAs 能够得到最有效的分离，考虑到部分PAAs 信号强度和流动相的洗脱能力，最终确定含0.07% （v／v）甲酸的甲醇溶液＋水为流动相，并进一步优化了洗脱程序。最终确定的梯度洗脱程序见1.4 节。200 μg／L 的PAAs 混合标准溶液的MRM 色谱图见图2，33 种PAAs 可在13 min 内得到较好的分离。

2.3.2 质谱条件的选择

为确定PAAs 的母离子和子离子，用10%（v／v）甲醇水溶液配制1 mg／L 单标准工作液，采用流动注射泵连续进样，用ESI＋扫描模式对每一种PAAs进行全扫描，通过全扫描质谱图确定33 种PAAs 及3 种氘代品的准分子离子峰［M＋H］＋。以［M＋H］＋为母离子，进一步确定母离子丰度较强时的锥孔电压；然后采用子离子扫描方式，选取丰度较强的特征碎片离子分别作为定量离子和定性离子，优化碰撞能量，最终确定MRM 参数。33 种PAAs 和3 种氘代内标物对应的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞电压见表1。

图2 200 μg／L PAAs 混合标准溶液的多反应监测色谱图Fig.2 MRM chromatograms of 200 μg／L PAAs mixed standard solution

2.4 线性关系和检出限

取1 ～200 μg／L 的PAAs 系列混合标准工作液，按照1.4 节条件进行UPLC-MS／MS 测定，以峰面积×（内标浓度／内标面积）（Y）为纵坐标，标准溶液质量浓度（X，μg／L）为横坐标，绘制标准工作曲线。在不含目标物的阴性样品中添加不同浓度的PAAs 混合标准溶液，测定后以PAAs 信噪比不小于3（S／N≥3）确定检出限（LOD），以S／N≥10 确定定量限（LOQ）。33 种PAAs 的相关系数、方法检出限及定量限见表2。33 种PAAs 在1 ～200 μg／L 之间具有良好的线性关系，检出限在6 ～10 μg／kg 之间，定量限在20 ～30 μg／kg 之间，满足相关检测要求。

表2 33 种PAAs 的相关系数、方法检出限、定量限、加标回收率和相对标准偏差Table 2 Correlation coefficients，limits of detection，limits of quantification，spiked recoveries and RSDs of the 33 PAAs

表2 （续）Table 2 （Continued）

2.5 方法的回收率和精密度

选取不含目标物的PS 色母粒和PE 色母粒进行加标回收率试验，每一种样品中添加3 个不同水平的标准溶液，按照优化好的样品前处理方法操作，每个浓度水平进行6 次平行试验，33 种PAAs 的加标回收率在61.3% ～119.8%范围内，相对标准偏差（RSD）在1.4% ～14.8%范围内（见表2）。

2.6 实际样品的测定

按照本方法对一系列食品级色母粒进行测定，包括紫色PS 色母粒、银色PS 色母粒、黄色PE 色母粒、绿色PE 色母粒、红色PE 色母粒、橙色PE 色母粒等。检测结果显示，所有被检测样品中均检测出o-ASD，含量为18.66 ～298.60 μg／kg；此外，紫色PS色母粒、黄色PE 色母粒中还检测出ANL，含量分别为11.66 μg／kg、7.20 μg／kg。图3 为紫色PS 色母粒检测出ANL 和o-ASD 的色谱图。

图3 实际色母粒样品检测出ANL 和o-ASD 的MRM 色谱图Fig.3 MRM chromatograms of ANL and o-ASD in an actual masterbatch sample

3 结论

本研究建立了同时检测食品级PS、PE 色母粒中33 种PAAs 的UPLC-MS／MS 检测方法。前处理方法简单，可有效去除基质中杂质的干扰，具有灵敏度高、检测效率高、简便快捷等特点，各项指标均可满足食品级色母粒中PAAs 的检测要求。

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