盆腔器官脱垂发病机制的比较蛋白组学研究

王静怡，孙智晶，朱兰，郎景和，梁硕

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科，北京 100730）

盆腔器官脱垂（Pelvic Organ Prolapse，POP）是由于盆底支持结构的缺陷、损伤或功能障碍造成的严重影响生活质量的一组疾病。在女性一生中，每五个人就有一个人由于POP而需要进行手术治疗，已成为非常值得关注的公共卫生问题［1］。而且随着人口老龄化，估计在未来40年，因脱垂而需要治疗的人数会翻倍增长［2］。

POP是多因素参与的复杂疾病，通常认为其与盆底结缔组织和肛提肌的组织形态学改变、盆底支持组织的神经病理改变、雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达以及一些特定蛋白酶的变化相关［3］。但是这些改变在疾病的发生发展中的作用机制不明，这就需要从分子生物学的角度对其进行进一步的探索研究。由于蛋白质自身特定的活动规律及多样性，在基因组水平上无法获知蛋白质的结构形成、转运定位、修饰加工、蛋白质与蛋白质之间的相互作用等信息，甚至有很多基因并不会翻译成蛋白。蛋白质组学以整个生物体的全部蛋白质为研究对象，一次可检测并分离出成千上万种不同的蛋白质，有利于发现新的蛋白和蛋白作用机制。因此，目前蛋白质组学在研究疾病的发生机制以及寻找有效的药物作用靶点方面得到了广泛应用。本研究将应用蛋白质组学技术，筛选POP患者与正常对照之间的差异表达蛋白，并对其在POP发生中所起的作用进行分析，为POP的诊治提供新的思路。

资料与方法

一、研究对象

选择在本院行子宫切除和盆底重建手术的POP患者（POP组）10例及同期行全子宫切除术的妇科良性疾病患者（对照组）10例。所有病例均满足：绝经至少2 年以上，一年内未服用过激素类药物，无功能性卵巢肿瘤等雌激素相关疾病。既往无慢性盆腔炎症、子宫内膜异位症、妇科恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等慢性呼吸系统疾病、结缔组织疾病、盆腔手术史。此外，病例组及对照组分别满足以下标准：（1）POP组：以子宫脱垂伴随阴道前后壁膨出为主要表现，脱垂程度在POP-QIII期及以上，不伴有压力性尿失禁症状的女性患者。（2）对照组：经过阴道检查无盆腔器官脱垂，无压力性尿失禁症状，行开腹或阴式全子宫切除的妇科良性疾病患者（如宫颈癌前病变、无功能卵巢囊肿等）。在月经情况、年龄、体重指数、产次等影响盆底障碍性疾病发生的重要因素匹配的前提下，两组患者进行配对，每组各选择5份标本。

二、实验方法

1.取材：组织标本离体后在宫颈旁开1cm 的主骶韧带处取材，大小约0.5cm×0.5cm。用生理盐水冲净血液，无菌纱布擦干后置入-80 ℃冰箱储存。

2.提取组织总蛋白：普通双向电泳分离，银染显色鉴定蛋白质抽提质量以及在胶图上的分布情况，并优化实验方法。

3.凝胶扫描：荧光标记的蛋白质凝胶样品通过GE Healthcare公司TyphoonTMVariable Mode Imager激光扫描成像系统扫描，荧光染料分别标记POP组、对照组以及内标，进行双向电泳得到双向荧光差异凝胶图谱。同时制作制备胶。对胶图进行匹配和胶内差异分析（Differential In-gel Analysis，DIA），筛选出两组之间｜AV.Ratio｜≥1.5，P＜0.05的差异表达蛋白质点。

4.图像胶内差异分析：将差异蛋白质点胶内酶解后，进行质谱点样和质谱鉴定，获得肽质量指纹图（Peptide mass fingerprinting，PMF）。 通 过MASCOT（Matrix Science，London）检索软件验证基质辅助激光解吸／离子化-飞行时间质谱仪（MOLDI-TOF质谱仪，Bruker，美国）得到的PMF数据，鉴定差异表达的蛋白质点。

三、统计学处理

计量资料采用配对及非配对t检验，P＜0.05有统计学意义。胶图分析在Protein Table中选取｜Av.Ratio｜≥1.5，P＜0.05的蛋白质斑点。

结 果

一、研究对象的临床一般情况

POP组和对照组两组患者的年龄、绝经时间、体重指数、产次经t检验，无明显差异（P＞0.05）（表1）。

二、子宫主骶韧带组织的荧光差异凝胶电泳（DIGE）

1.凝胶扫描结果：凝胶经三种不同波长的激光扫描后，可得到三个分别由荧光染料Cy2、Cy3、Cy5（Amersham Biosciences，美国）标记的不同蛋白质样品的图像及重叠的胶内差异图像。经DeCyder软件分析，在Gel 1检测到1 049个蛋白点，Gel 2检测到1 157个蛋白点，Gel 3检测到1 056个蛋白点，Gel 4检测到1 151个蛋白点，Gel 5检测到1 143个蛋白点。平均检测率为1 111±54个斑点。凝胶间匹配率最低为90.7%，具有较好的敏感性和重复性。DIGE胶图扫描结果见图1。

2.图像胶内分析：对获得的图像进行胶内差异分析，同时利用内标进行胶间分析，经t检验分析，在POP组与对照组间确认丰度差异≥1.5倍，P＜0.05的蛋白质点79个，经过逐一分析并手工确认，排除杂质或蛋白量极低的点，最终确定33个在两组之间有显著差异的蛋白质点，这些蛋白质点在POP组均为低表达，最大下调倍数8.5倍。

三、POP患者和对照组差异蛋白的质谱鉴定

1.检索结果及质谱鉴定：通过胶内酶解、质谱鉴定和数据库的检索，30个蛋白质点得到阳性结果，得分较高，质谱信号好，信噪比高，结果可信（P＜0.05）。并将30个蛋白质点的理论分子量和等电点与凝胶上相应斑点的分子量和等电点对比后，排除5个明显不符合实际情况的结果（胶内斑点的实际分子量远远小于鉴定出的蛋白质的理论分子量）后，共计成功鉴定出蛋白质25个，鉴定率达83.3%。25个差异蛋白质点在POP组中均表达下调。多数蛋白质出现重复鉴定，考虑为蛋白质修饰等原因造成。但重复蛋白质点相邻，且强度变化趋势一致，再次证明结果的可靠性。合并重复鉴定的蛋白，获得半凝乳素-1、亲环素蛋白A、丝切蛋白等差异蛋白（表2）（图2）。

图1 POP组与对照组的2D-DIGE图谱

表1 研究对象的一般情况（±s）

表1 研究对象的一般情况（±s）

注：＊所有患者均为阴道分娩

组 别 例数 年龄（岁） 绝经时间 BMI（kg／m2） 产次＊POP组5 66.6±10.2 13.6±10.8 24.4±2.1 2.0±1.0 5 66.6± 7.8 15.8±11.3 23.9±3.0 1.8±0.8对照组

表2 主要差异蛋白列表

2.差异表达蛋白质的细胞定位和功能分析：对鉴定的蛋白质，根据Swiss-Prot库的注释信息进行功能和细胞定位分析。本试验筛选出的差异蛋白共涉及118 个GO 分类，其中与生物学过程、分子功能、细胞成分相关的GO 分类分别为52、41、25个，分别占44.07%、34.75%、21.19%。多个GO 分类发生了显著变化（P＜0.05）。

讨 论

一、研究对象和实验材料的选择

通常认为盆腔器官脱垂来源于支持结构的损伤。盆底支持结构主要包括韧带、肌肉和筋膜，整体理论中阴道支持结构三个水平：水平Ⅰ为上层支持结构，主要为主韧带-宫骶韧带复合体；水平Ⅱ为旁侧支持结构，主要是肛提肌群及膀胱、直肠阴道筋膜；水平Ⅲ为远端支持结构，主要是会阴体及括约肌。主韧带-宫骶韧带复合体是盆腔器官的最上层支持结构，为主要支持结构，其生物学状态的改变与POP 的发生密切相关。同时，在子宫切除手术中，主韧带-宫骶韧带复合体的获得并不会额外增加对患者盆底支持结构的损伤，因此相比于肛提肌等其他支持结构，主骶韧带复合体更适合作为研究标本。

大量研究证明［4-5］，年龄、绝经状态、阴道分娩、高体重指数（BMI）等是POP 发生的危险因素。因此，为了排除这些已知的危险因素对实验结果的影响，本研究严格控制研究对象的入组和排除标准，使POP组与对照组研究对象在各方面相匹配。研究表明POP与绝经后雌激素低下状态密切相关［6］，因此在研究对象的排除标准中除外合并子宫肌瘤、子宫内膜病变等受雌激素影响疾病的患者。

二、差异表达蛋白的功能分析及其与POP的相关性

在本研究中，POP 组患者主骶韧带中半凝乳素-1含量较对照组下调，差异倍数达4.06倍，目前尚缺少半凝乳素在POP的发生中作用机制的报道。半凝乳素（galectin）是生物体内广泛存在的一类糖结合蛋白，属于凝集素家族，迄今已经发现了14个成员［7］。近年来，半凝乳素-1在神经损伤修复中所起的作用逐渐成为研究热点。Gaudet等［8］的研究发现，半凝乳素-1 在大鼠脊髓损伤修复中起到作用，在未受损的脊髓中，无半凝乳素表达，在脊髓损伤后，半凝乳素表达显著上调，尤其是受损节段。半凝乳素通过改善趋向受损部位的巨噬细胞的功能，可以促进受损外周轴突的再生。Sasaki等［9］发现在体外实验中，半凝乳素-1能够在中枢神经系统受损后抑制神经元的凋亡和星形胶质细胞增殖，同时诱导星形胶质细胞分化。对神经元的生长、分化以及突触可塑性的形成起重要作用。半凝乳素-1 对周围神经同样具有促进损伤后修复的作用。研究报道［10-11］，氧化状态下的半凝乳素-1能够刺激巨噬细胞分泌轴突再生促进因子，促进周围神经损伤后轴突及树突再生。Kadoya等［12］研究发现。切断坐骨神经的大鼠通过微量渗透泵给予氧化型半凝乳素-1后，能够促进其手术部位的神经再生，同时也促进受损神经功能的恢复［13］。提示半凝乳素-1在神经损伤和再生的早期阶段可能发挥了重要作用。

神经支配与肌肉功能关系密切。而半凝乳素-1在促进受损神经恢复的同时，也能够通过促进轴突的生长，恢复受损部位肌肉的神经营养，从而调节新生骨骼肌中肌小管的生长，使肌肉恢复正常的功能和结构［14］。在POP 的发病机制研究中，之前的差异基因研究表明，POP与盆底组织的失神经支配状况关系密切［15］。在本研究中，POP组患者主骶韧带中半凝乳素-1含量较对照组下调，可推测POP患者体内存在半凝乳素-1不足。半凝乳素-1 的不足一方面会导致患者神经干细胞增殖和分化能力下降，分化成神经元的细胞减少，使POP患者盆底支持组织的神经支配较正常人群减少，盆底支持组织功能减弱。另一方面，在腹压增高、分娩等盆底支持结构受到损伤的情况下，由于半凝乳素-1 缺乏，则无法促进受损神经的修复和再生，使盆底组织失神经支配长期存在，引起并加重POP。

在本实验结果中，POP组患者亲环素A 含量相比于对照组下调，最大差异倍数达2.27倍。亲环素A 具有许多重要的生物学功能，研究发现大鼠的神经细胞以及其他组织细胞遭受氧化应激以及缺血缺氧等损伤时，细胞内的亲环素A 表达明显升高，并且通过受体CDl47介导的有丝分裂活化蛋白激酶ERKl／2信号通路，发挥对神经元的保护作用，减少细胞凋亡［16-18］。在血管平滑肌细胞中环孢素A 的分泌，能够刺激平滑肌细胞的增殖和炎性细胞移行，促进上皮细胞凋亡，发挥在心血管事件氧化应激反应中的重要调节作用［19］。可见亲环素A 表达的升高是一种内源性的保护机制，参与细胞损伤的应答。考虑与半凝乳素-1一样，在盆底支持结构受到损伤的情况下，由于亲环素A 缺乏，导致对神经细胞的保护作用不足，使盆底组织失神经支配，最终导致POP的发生。

丝切蛋白通过调节肌动蛋白参与早老性痴呆、帕金森氏病等神经退行性疾病的发生发展。丝切蛋白肌动蛋白复合体在线粒体损伤应答中形成最初的神经保护反应，但是当应激持续存在时，则会诱导神经元功能的损伤和丧失。可见丝切蛋白肌动蛋白复合体的调节异常和功能障碍在神经退行性病变发生发展中可能起到促发作用［20］。本研究中丝切蛋白下调2.02倍，也考虑可能与盆底支持组织中的神经损伤修复相关。

本实验采用蛋白质组学技术，通过双向差异凝胶电泳、质谱鉴定以及生物信息学方法，对POP 患者的主骶韧带中蛋白质的表达特征进行研究。研究发现了在POP组中显著下调的蛋白，并涉及多个功能分类，提示POP的发生涉及了复杂的分子生物学机制，并推测神经的损伤修复可能与POP的发病密切相关。进一步需要增加样本量进行验证实验，明确差异蛋白在POP盆底支持组织的表达，并进一步明确其作用机制。

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