HPLC 法测定青荚叶中的木犀草素和肉桂酸的含量
2015-12-24梁春辉张寒李雪宁
梁春辉，张寒，李雪宁
(1.西安市儿童医院，陕西 西安 710003;2.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021;3.兴平408 医院，陕西 咸阳 713100)
青荚叶［Helwingia japonica(Thunb)］为山茱萸科青荚叶属植物，又名叶上花、叶上果，全株入药，其根味辛、微甘、性平，能驱风除湿、祛瘀活血。可治胃痛、痢疾、便血、子宫脱出等病症。其叶入药，可治小儿高烧，外用治烧烫伤，毒咬伤，也有清热解毒，消肿止痛的功效。其干燥茎髓入药，药名小通草，具有清热利尿、下乳等作用。国内外有关青荚叶的研究较少。有文献报道关于青荚叶的化学成分有:谷甾醇、β-胡萝卜苷、羽扇豆醇、桦木醇、桦木酸、棕榈酸甘油酯、桂皮酸、木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷［1］、表儿茶素［2］、肉桂酸、α-香树脂醇、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷［3］、4'-羟基-7-O-葡萄糖-2，3-二羟黄酮甙、黄豆甙、5-葡萄糖芹菜甙、7-O-葡萄糖芹菜甙、4-O-葡萄糖香豆酸、葡萄糖咖啡酸［4］等。国内外现有文献记载中未见青荚叶中肉桂酸和木犀草素的含量测定，因此本文采用HPLC 法对青荚叶中肉桂酸和木犀草素含量进行测定。在选定的色谱条件下，供试溶液中肉桂酸和木犀草素与相邻组分分离度良好。经方法学考察，方法的重复性、稳定性、精密度、加样回收率均符合有关规定，可用于该药材的质量控制。
1 实验部分
1.1 材料与仪器
木犀草素对照品(上海金穗生物科技有限公司，JS90108-20 mg);肉桂酸对照品，西安医学院化学合成室制;甲醇，色谱纯;磷酸、乙醚、甲酸均为分析纯;青荚叶采自秦岭太白山。
Agilent 高效液相色谱仪;KQ-300B 型超声波清洗器;GR-202 型分析天平。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为室温，进样量20 μL。木犀草素:流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，检测波长350 nm;流速1.0 mL/min;肉桂酸:流动相为甲醇-1. 67% 冰醋酸水溶液(50 ∶50)，检测波长270 nm，流速1 mL/min，在以上色谱条件下，理论塔板数为2 000 以上，木犀草素和肉桂酸峰的分离度均符合要求。
1.2.2 对照品溶液的配制
1.2.2.1 木犀草素对照品溶液的配制 精密称定木犀草素对照品3.4 mg，置10 mL 容量瓶中用甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含0.34 mg 的木犀草素对照品溶液。
1.2.2.2 肉桂酸对照品溶液的配制 精密称定肉桂酸对照品6.0 mg，置10 mL 容量瓶中用甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含0.6 mg 的肉桂酸对照品溶液。
1.2.3 供试品溶液的配制
1.2.3.1 木犀草素供试品溶液的配制 称取青荚叶药材5 g(3 份)，置250 mL 带塞锥形瓶中，加150 mL甲醇浸泡140 min，再超声提取1.5 h，抽滤，取滤液，残渣再加100 mL 甲醇超声提取1 h，抽滤，取滤液，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，加50 mL 水溶解，用乙醚萃取3 次(每次加乙醚30 mL)萃取液水浴蒸干，甲醇溶解，移至25 mL 容量瓶，甲醇定容，得供试品溶液。
1.2.3.2 肉桂酸供试品溶液的配制 称取青荚叶药材5 g(3 份)，置150 mL 索氏提取器中，加入100 mL甲醇∶甲酸(95∶5)，浸泡18 h，然后用加热回流提取2 次，第1 次提取2 h，第2 次提取1 h，合并两次提取液，抽滤，旋转蒸发仪蒸干，加甲醇溶解并转移至50 mL 容量瓶中，甲醇定容，得供试品溶液。
1.2.4 测定方法 分别取对照品溶液和供试品溶液5 mL，用0.45 μm 有机微孔滤膜过滤至微量离心管中，精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，按
1.2.1节色谱条件测定。
2 结果与讨论
2.1 木犀草素测定
分别吸取微量离心管中对照品溶液，供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按1.2.1 节色谱条件测定，结果见图1、图2。由图1、图2 可知，在供试品中木犀草素与对照品色谱峰保留时间一致，达到基线分离。
图1 木犀草素对照品液相色谱图Fig.1 Luteolin control liquid chromatogram
图2 青荚叶供试品液相色谱图Fig.2 Helwingia sample liquid chromatogram
2.2 肉桂酸测定
分别吸取微量离心管中对照品溶液，供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按1.2.1 节色谱条件测定，结果见图3、图4。由图3、图4 可知，在供试品中肉桂酸与对照品色谱峰保留时间一致，达到基线分离。
图3 肉桂酸对照品液相色谱图Fig.3 Cinnamic acid standard HPLC chromatogram
图4 青荚叶供试品液相色谱图Fig.4 Helwingia sample liquid chromatogram
2.3 线性关系的考察
2.3.1 木犀草素线性关系 精密量取1.2.2.1 节对照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 至5 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定。以对照品进样浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)分别绘制标准曲线，得木犀草素回归方程为Y = 12 637X +11.479，R2=0.999 9(n =5)。结果表明，木犀草素进样量在0.003 4 ～0.054 4 mg 线性关系良好。
2.3.2 肉桂酸线性关系 精密量取1.2.2.2 节对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mL 至5 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定。以对照品进样浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)分别绘制标准曲线，得肉桂酸回归方程为Y =1.5E +5X－509.10，R2=0.999 4(n =5)。结果表明，肉桂酸进样量在0.000 24 ～0.002 4 mg 线性关系良好。
2.4 重复性实验
精密量取1.2.2 节木犀草素、肉桂酸及对照品溶液各6 份(20 μL)，分别进样，测定峰面积。结果木犀草素的RSD = 0. 034 9%，肉桂酸的RSD =1.98%。表明本实验重复性良好。
2.5 稳定性实验
精密量取1.2.2 节木犀草素和肉桂酸对照品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h 各进样20 μL，分别测定它们的峰面积。结果木犀草素和肉桂酸的RSD 分别为0.058 7%和1.49%。表明二者在24 h 内稳定。
2.6 加样回收率实验
2.6.1 木犀草素 取木犀草素供试液6 份，精密量取500 μL，分别加入对照品溶液100 μL，混匀，即得。分别进样20 μL 测定，计算加样回收率。结果平均回收率为99.67%，RSD 为0.26%。
2.6.2 肉桂酸 取肉桂酸供试液6 份，精密量取1 000 μL，分别加入对照品溶液200 μL，混匀，即得。分别进样20 μL 测定，计算加样回收率。平均回收率为93.64%，RSD 为1.45%。
2.7 样品测定
取1.2.3 节的供试品溶液，用0.45 μL 微孔滤膜过滤至微量离心管中，取20 μL 在1.2.1 节色谱条件下分别进样测定，计算各个成分含量，结果见表1。
表1 样品测定结果Table 1 Samples for the determination of results
3 结论
(1)有相关文献记载［5-6］，木犀草素的检测波长有269，283，350 nm，实验中发现在350 nm 处木犀草素的峰型和峰面积均十分理想，故本实验采用350 nm 对木犀草素进行检测;肉桂酸的检测波长有270，280 nm，实验中发现在270 nm［7-8］处肉桂酸的峰型和峰面积均十分理想，故本实验采用270 nm 对肉桂酸进行检测。
(2)采用高效液相色谱法测定青荚叶药材中总黄酮(以木犀草素为指标)、肉桂酸的含量。该法灵敏、简单易行，专属性、重复性、回收率均符合要求。实验结果表明，在青荚叶中，木犀草素的含量太低，实际检测意义不大。而肉桂酸的含量较高，可以考虑用检测肉桂酸的含量来作为控制青荚叶的质量指标成分之一。
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