维生素D与细胞自噬的相关性及自噬相关基因PTEN的蛋白表达

刘 蓉 邱 龄* 武海燕 吴晨栋

(山西医科大学第二医院心内科,山西 太原 030001)

维生素D与细胞自噬的相关性及自噬相关基因PTEN的蛋白表达

刘 蓉 邱 龄* 武海燕 吴晨栋

(山西医科大学第二医院心内科,山西 太原 030001)

目的比较维生素D(VD)作用下的老龄大鼠和正常饮食组老龄大鼠肝脏细胞发生自噬的程度，以探索VD与自噬的关系，同时比较两组大鼠肾脏组织中自噬相关因子PTEN的蛋白表达。方法将40只24个月老龄雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组各20只，实验组大鼠每天经灌胃给予最佳剂量的VD(预实验得到最佳浓度3.704 µg/kg)，对照组正常饮食。6个月后，活体状态下取1 mm3肝脏组织4 ℃保存，100 g肝组织-70 ℃冻存，用透射电镜观察各组肝脏细胞自噬泡的数量；用免疫组化检测PTEN蛋白表达。结果电镜下实验组细胞均出现典型自噬细胞形态学改变。与正常组相比，VD作用下的大鼠肝脏细胞自噬泡占细胞质总面积的比值均明显提高(P＜0.01)，免疫组化方法示实验组细胞PTEN表达较正常组显著升高(P＜0.01)。结论透射电镜检测细胞自噬方法证实VD可增强细胞发生自体吞噬，同时细胞的PTEN蛋白表达量也相应提高，推测VD引起自噬过程中可能与PTEN有关。

自体吞噬；VD；透射电镜；免疫组化；PTEN

维生素D(VD)是一种脂溶性维生素，它的活性形式1，25-(OH)2VD3作为激素在人体不同的细胞控制不同的基因表达。有综述提到VD可能是通过提高自噬从而延缓肿瘤等多种疾病病情，促进人类健康[1]。自噬是真核细胞中一种重要的分解代谢过程，可以降解细胞中受损的大分子物质及细胞器，并可使之再循环成为细胞所需的能量及基本物质[2]。最近有实验证明，自噬和大量的疾病有关，特别是肿瘤等疾病的发生可能都是由于自噬程度的降低[3-4]。自噬相关基因PTEN即磷酸酶与张力蛋白同源物是调节自噬体形成的关键因素[5]。过去都是在病理情况下研究VD与自噬的关系从而起到治疗疾病的作用，那么在生理情况下VD是否一样可以通过诱导自噬而预防疾病。本实验中我们要观察在老龄大鼠中VD是否可以增强细胞自噬以及VD引起自噬的转导通路中是否有PTEN的参与，过去有研究表明提高自噬可以延缓衰老[6]。希望预期结果对衰老具体机制的研究及抗衰老策略的探索提供实验基础和理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：40只24个月龄健康雄性SD大鼠，体质量320～470 g，由山西医科大学动物实验中心提供，随机分为两组，即实验组和对照组，两组均在普通光照环境下饲养，饲料为全价颗粒料(主要营养成分：粗蛋白19.31%、粗脂肪2.9%、粗纤维3.1%、水分8.7%、钙0.5%、磷0.5%)，温度20～24 ℃，湿度55%～80%，自然光照，饮用自来水，每周换垫料3次。普通饮食洗脱两周后开始对实验组进行干预，即每天同一时间经灌胃方式给予实验组大鼠的VD(经预实验得到最佳VD浓度)。喂养6个月后，由于大鼠体质量增加2倍，需先用乙醚麻醉，然后再用浓度为1%的戊巴比妥麻醉后暴露肝脏，快速剪下一小块肝脏组织，在预冷的固定液内于30 s将取下的组织切成1 mm3大小的组织块，置于2%的戊二醛固定液2 h后缓冲液冲洗后浸泡，4 ℃保存标本备用。切取100 g肝脏组织，-70 ℃冻存备用。

1.2 试剂和仪器：JEM-100CX II型透射电镜(日本日立HITACHI公司H-600)，超薄切片机(瑞典LKB公司 LKB-Ⅴ)。PTEN兔抗人多克隆抗体购自博士德公司。

1.3 细胞自噬的检测：透射电镜观察肝细胞自噬泡 经过常规取材、双重固定、脱水、浸透、包埋、切片(厚度为50 nm)醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后，透射电镜观察、拍照、记录。采用Image-Pro Plus6.0软件计算电镜照片中各个细胞中自噬泡占细胞质总面积的比例，用SPSS 17.0对结果进行数据分析，两组间比较进行t检验，以α=0.05作为检验水准，P＜0.05具有统计学差异。

1.4 免疫组化染色检测PTEN蛋白表达量

1.4.1 取材与切片准备：动物处死取材，分别取大鼠的肾脏组织置于10.0%甲醛中固定12 h，常规脱水，石蜡包埋，3 µm厚切片裱于涂有多聚赖氨酸的清洁玻片上，置80 ℃烤箱1 h，低温保存备用。

图1 正常组 10×103万倍

图2 VD组 10×103万倍

图3 自噬泡 60×103万倍

图4 正常组100倍

图5 正常组400倍

图6 VD组100倍

图7 VD组400倍

1.4.2 主要试剂：小鼠抗人单克隆抗体pten为一抗，生物素化马抗小鼠IgG为二抗，均购自北京博士德公司；免疫组化试剂盒购和显色剂DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4.3 步骤：石蜡切片常规脱蜡至水后，放置于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，微波炉中高火4 min，低火8 min修复抗原滴加双氧水温浴10 min，用正常山羊血清封闭液孵育10 min中和非特异性抗原，再将切片滴加1∶50一抗溶液温浴1 h，4 ℃过夜，最后，将切片依次用生物素标记马抗小鼠IgG和辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育各30 min，DAB染色2 min切片中PTEN表达蛋白阳性区域显色为棕黄色至棕褐色。

1.5 图像分析：将免疫组化切片经数码显微摄像后输入计算机，用Image-Pro Plus 6.0软件分析各组免疫组化染色阳性区的平均光密度值，光密度与染色强弱呈正比，用SPSS 17.0对结果进行数据分析，两组间比较进行t检验，以α=0.05作为检验水准，P＜0.05具有统计学差异。

2 结 果

2.1 电镜观察：透射电镜下正常组肝脏细胞形态不规则，细胞核圆形，核内染色质分布均匀，核仁明显；肝脏细胞内脂滴较多，线粒体嵴结构清晰，粗面内质网分布在细胞质内，自噬溶酶体少见(图1)，作用VD的实验组肝脏细胞结构清晰，细胞核圆形，核内染色质轻度边集，细胞质内线粒体丰富，线粒体轻度肿胀，体积增大，内质网扩张，自噬溶酶体最多(图2)自噬泡为单层或双层膜包裹着的处于不同降解阶段的胞质成分或废弃的细胞器经消化降解后形成的板层样结构(图3)。

2.2 自噬泡占细胞质总面积的比值：经Image-Pro Plus6.0软件计算各组细胞电镜照片中自噬泡占胞质总面积的比例结果显示：VD作用下的实验组(0.0487±0.0044)均较正常组(0.0091±0.0025)明显增加(表1)。

表1 各组细胞中自噬泡占胞质总面积的比值(,n=18)

表1 各组细胞中自噬泡占胞质总面积的比值(,n=18)

注:与正常组比较,*P＜0.01

组别 正常组 VD组比值 0.0091±0.0025 0.0487±0.0044*

2.3 免疫组化染色结果：pten在两组肾脏中均有表达(图4～7)，但两组间的PTEN蛋白表达均有差异有统计学意义(P＜0.05)。VD作用下的实验组(0.406±0.098)均较正常组(0.0168±0.078)明显增加(表2)。

表2 正常饮食组与VD组PTEN的表达(光密度值 ,n=18)

3 讨 论

在过去100年中，国内外对VD在钙磷代谢方面的研究已经很透彻。因为VD可以经紫外线照射在体内生物合成，所以有人提到人们可以通过每天长时间日晒来增加体内的VD水平，但发现紫外线损伤皮肤并增加皮肤癌，由此开始质疑VD的作用。后来研究发现这是因为紫外线中的长波可以破坏人体血液中的维生素D，短波紫外线对人体的伤害很大，短时间照射即可灼伤皮肤，长期或高强度照射还会造成皮肤癌，只有中波能促进体内矿物质代谢和维生素D的形成，从中我们得到对皮肤的损害与短波紫外线有关，与产生VD的中波紫外线无关。所以我们可以通过服用VD增加体内VD水平从而弥补了长时间高强度日晒破坏皮肤的不足。最近10年，通过细胞、分子生物及基因等多方面更精细的研究发现VD的活性形式1，25-(OH)2VD3作为一种多效型激素在人体许多不同的细胞中调控着将近900多种不同的基因表达并调控它们的增殖、分化与存活，它对人类健康的作用开始渐渐浮现。许多流行病学数据表明1，25-(OH)2VD3及其类似物除能治疗与钙有关的预防或治疗疾病(如佝偻病，软骨病，骨质疏松症和甲状旁腺功能亢进症)外，也延缓许多其他疾病包括牛皮癣，以及某些类型的癌症传染病(如肺结核，慢性肝炎)，心血管和神经系统疾病[7-11]。Mathiasen等第1次通过VD及其类似物EB108对肿瘤细胞的抑制增殖和分化作用的研究推测在肿瘤细胞中VD可以通过提高自噬而延缓病情[12]。Ordonez-Moran等在研究VD和肿瘤关系中推测二者之间可能与自噬有关[13]。对于VD和结核病的研究已有很久的历史，但Yuk等在2009年第1次证实1，25-(OH)2VD3是通过自噬而治疗结核病，而并非人们原先设想的是通过钙化结核灶而治疗结核病。此外，生理条件下相关浓度的1，25-(OH)2VD3诱导单核细胞和巨噬细胞的自噬现象表明自噬现象并不局限于肿瘤，可能在生理条件下诱导自噬[14]。

细胞自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，是生物在其发育、老化过程中都存在的一个净化自身多余或受损细胞器的共同机制[15]。生命体籍此维持蛋白代谢平衡及细胞环境稳定，这一过程在细胞清除废物、结构重建、生长发育中起重要作用。目前许多学者提出饮食限制延缓衰老的效果可能与细胞自噬有关。国内并有实验证明自噬确实可以延缓衰老。

PTEN是至今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色体10q23.3，全长200 kb，由9个外显子和8个内含子组成，编码403个氨基酸组成的蛋白质。PTEN可通过促进自噬体的形成在肿瘤的发生发展中起重要作用[16]。它是自噬的信号转导通路中重要的相关基因，是自噬的正向调节分子，它可以以通过催化PIP3向PIP2的转化来抑制AKT的活性，从而解除classIPIK3/PKB途径对自噬的抑制[17]。最近有实验证明有些药物在影响细胞自噬过程中，可以影响到PTEN的蛋白表达[18]。

基于以上研究，在肿瘤、肺结核等疾病中，VD均是通过自噬而延缓及治疗疾病的。明确过去的研究资料主要是在病理状态，那么对于正常的老年人群，适当剂量的VD是否一样可以在生理条件下通过细胞自噬而延缓衰老，目前并没有相关研究报道。为此我们设计了本实验，通过给予实验组老龄大鼠最佳剂量的VD，对照组正常饮食，6个月后，比较实验组和对照组的自噬程度及PTEN的蛋白表达，实验证实服用VD组大鼠较正常组相比肝脏细胞发生自体吞噬的程度明显增强，PTEN蛋白表达也明显提高，差异有统计学意义，结果表明VD可以诱导细胞自噬，其机制可能是通过PTEN参与的信号转导途径来诱导细胞自噬。这为VD的延缓衰老的效果和细胞自噬的具体机制提供了有关实验依据。为以后延缓衰老及预防衰老相关疾病的发生有着重要的意义。

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Effect of Vitamin D on Autophagy and Expression of PTEN

LIU Rong, QIU Ling, WU Hai-yan, WU Chen-dong
(Department of Cardiology, Second Hospitul of Shanxi Medical University ,Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo probe into the relationship between vitamin D(VD)and autophagy by comparing two groups which are VD group and normal diet group of older rats liver’s autophagy level, meanwhile compare the expressions of the autophagy-related factor PTEN of kidney between the two groups.Methods24-month-aged rats were randomly grouped into two groups -control group(normal dieting), experimental group(the appropriate VD by gavaging)with 20 rats in each group. After six months, get liver tissues by autopsy, then make 1 mm3liver stored at 4 ℃ meanwhile 100 g liver tissues at -70 ℃. To detect the amount of autophagic vacuoles in liver cell by TEM(transmission electron microscope); using immunohistochemical staining method to detect the expression of PTEN.ResultsTypical morphological changes of autophagy can be seen in cell. Compared with control group, the ratio of the amount of autophagic vacuoles to that of total cytoplasm in experimental group increased significantly(P＜0.01), PTEN in experimental group increased significantly(P＜0.01).ConclusionThe detection methods prove that VD can enhance the probability of autophagy in cells, Meanwhile the result that PTEN expression varied with the extension of autophagy, indicate that the autophagy induced by VD maybe related to PTEN.

Autophagy; VD; Transmission electron microscopy; Immunohistochemical; PTEN

R363

B

1671-8194（2015）05-0001-03

山西省自然基金资助项目(2010011054-2)

*通讯作者