TNF-α、IL-6、IL-8在 Modic I型改变腰椎终板与椎间盘髓核中的表达及关系研究

2015-12-23庄汝杰陈冠军庄伟陈扬童培建

浙江医学 2015年4期

庄汝杰陈冠军庄伟陈扬童培建

庄汝杰陈冠军庄伟陈扬童培建

目的探讨腰椎Modic I型改变的腰椎终板与椎间盘髓核中TNF-α、IL-6、IL-8的相关性。方法收集30例因下腰痛入院手术治疗并行腰椎MRI检查确认为腰椎Modic I型改变患者的术中病灶椎间盘标本，进行免疫组化检测，并观察椎间盘组织病理变化及炎症因子的表达，IL-6、IL-8相对表达水平以相对表达量△Ct或（2-△Ct×104）进行分析。结果Modic I型终板中TNF-α表达水平（9．2±0．7）高于髓核（7．2±0．5），差异有统计学意义（P＜0．05）；髓核中△Ct IL-6、△Ct IL-8相对表达量（6．34±1．82、10．62±1．88）高于终板（4．07±1．86、5．92±1．31），差异均有统计学意义（均P＜0．05）。结论Modic I型终板中TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平明显高于髓核，其引起下腰痛的原因主要为终板的炎症改变。

Modic I型炎症因子腰椎间盘终板

腰椎Modic改变是美国放射科医师Modic在20世纪80年代首先发现并命名的，现认为Modic I型为炎症水肿期。近年来，笔者共收集30例因下腰痛而行手术治疗的Modic I型患者的病变椎体终板和髓核，检测其TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平并探讨两者表达水平差异的关系，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集2011年6月至2012年12月浙江中医药大学附属第一医院收治的30例Modic I型改变的慢性下腰痛患者，其中男12例，女18例；年龄43～69岁，平均（54.13±6.35）岁。患者病史9～20个月，平均（12.32±2.13）个月；临床表现：右下肢小腿外侧及足背麻木9例，右下肢小腿内侧麻木3例，左下肢小腿外侧及足背麻木8例，左下肢小腿内侧麻木2例，伴有间歇性跛行8例；影像学检查结果提示病变部位L3～L4节段12例，L4～L5节段18例，均为单一节段病变，且局部存在神经压迫或椎管狭窄；患者腰椎MRI检查结果由2位高年资骨科医师进行独立双盲分析后认为属于腰椎终板变化中的Modic I型改变的患者。手术采用腰椎后路手术，根据患者实际情况选择融合或非融合。

1.2 方法手术取出病变椎体的髓核和终板组织送病理检查做成石蜡切片，并行TNF-α、IL-6和IL-8免疫组化染色，显微镜下观察结果：在细胞质或核内出现黄、棕色颗粒为阳性。免疫组化半定量计分方法[1]：首先根据染色强度评分，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。染色深浅需与背景着色相对比，再将阳性细胞所占的百分比评分，0分为阴性，1分为阳性细胞＜10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积＞3分，免疫反应(+)。再将手术时所采取的椎间盘髓核、终板组织，放入冻存管中，置于-80℃超低温冰箱中冻存备用，行实时荧光定量RT-PCR检测。采用Primer 5.0引物设计软件和引物设计原则进行PCR引物的设计，然后由上海生物工程有限公司负责合成，序列见表1。cDNA合成操作步骤（可参考TAKARA RT试剂盒）：（1）短暂离心后，加入如下组分：5×第一链反应缓冲液2μ1、Oligo dT引物0.5μl逆转录酶0.5μl，总RNA 2μl，取DEPC水补齐到10 μl；（2）轻轻混匀后，混合物在37℃中放置20min；（3）85℃加热15s终止反应，至冰上进行后续试验或冷冻保存。各个目的基因的相对表达水平以相对表达量△Ct或（2-△Ct×104）进行分析（注：△Ct数值大，说明组织表达量反而低）。

表1 GAPDH、IL-6、IL-8、PGE-2引物序列产物及Tm值

1.3 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

ModicⅠ型终板中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8分别为9.2±0.7，4.07±1.86，5.92±1.31，髓核中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8分别为7.2±0.5，6.34±1.82,10.62± 1.88，终板中TNF-α、△Ct IL-6、△Ct IL-8与髓核比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），即终板中的TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平明显高于髓核。

3 讨论

TNF-α、IL-6、IL-8均属于炎症过程中炎症介质的细胞因子类。此外，TNF-α亦属于肿瘤坏死因子超家族成员，是一种主要由激活的巨噬细胞分泌的能够抑制成骨细胞和刺激破骨细胞作用的炎症介质，其在炎症过程中发挥重要作用，通过调节细胞增殖和凋亡，实现对肿瘤细胞的细胞溶解、抑制增殖、诱导凋亡过程，且影响多种正常细胞的生长分化，并通过改变内皮细胞基因表达激活内皮细胞产生其他炎症介质（如IL-1、IL-6、IL-8、CSF等）。TNF-α参与炎症反应的全部过程，在炎症局部血管通透性增加、白细胞附壁、渗出和致病因子消除等过程中均起到促进作用,TNF-α可引起发热、外周血中白细胞改变等，故有学者将其称为“广谱炎症介质”[2]。许多学者研究证明，TNF-α水平在腰椎间盘退化症的患者中较高[3-7]。IL-6、IL-8均属于主要由单核-巨噬细胞分泌的细胞因子，其中IL-6作为一种多效应的细胞因子，对细胞的生长、分化甚至基因表达都有影响，并且作为重要的炎症递质在退行性骨病发病中发挥重要作用，其介导B细胞的进一步分化，刺激肝细胞合成急性期蛋白，促进免疫球蛋白的合成、分泌，增强体液免疫功能，参与炎症反应。此外，IL-6作为炎症反应催化剂，可刺激炎性细胞聚集、激活和炎性递质的释放，促进腰椎间盘退变的炎症过程。IL-8则主要通过吸引和激活中性粒细胞，从而导致机体局部的炎症反应。

本研究结果发现，ModicI型病变椎体中终板TNF-α的表达水平明显高于髓核，终板组织中△Ct IL-6、△Ct IL-8值明显低于髓核组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。相对表达量越高，说明表达量反而越低，终板IL-6、IL-8的表达水平比髓核的更高，表明炎症在终板中的程度较髓核更为明显。

本研究结果明确了终板在Modic I型改变中的重要性，这将对临床治疗具有指导意义；但是本研究也存在一些不足之处，譬如：由于样本数量较少，或许不能全面地、准确地反映炎症因子在Modic I型改变中的作用；研究的时间太短，不能全面地反映出整个疾病发展的过程。今后应增加收集的病例数，延长随访，进一步亚组分析研究。

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ObjectiveTo investigate the expression of TNF-α,IL-6 and IL-8 in lumbar vertebral nucleus pulposus and end plate tissue in patients with Modic type I changes．MethodsThirty patients with low back pain and MRI-confirmed lumbar end-plate Modic type I changes underwent surgical treatment．The disc specimens were collected in the surgery and examined with Immunohistochemistry for expression of TNF-α,IL-6 and IL-8．The association of pathological changes of intervertebral disc tissue with the expression of TNF-α,IL-6,IL-8 and the relative expression of Ct or(2-△Ct×104)was analyzed．ResultsThe expression level of TNF-α in lumbar end plates was higher than that in nucleus pulposus(9．2±0．7,7．2±0．5,P＜0．05); while the expressions of IL-6 and IL-8 in nucleus was higher than those in end-plate(6．34±1．82,4．07±1．86 and 10．62±1．88, 5．92±1．31,respectively,P＜0．05)．ConclusionThe expression of inflammatory factors in lumbar endplate were above that of nucleus．The low back pain was caused by the inflammation changes in lumbar end plate．

Modic I type Inflammatory factorLumbar intervertebral disc Lumbar end plate