RHD3遗传互作因子突变体rren108的表型观察及遗传学分析

杨 亚，袁德义，范晓明，李建波，卢孟柱，陈 军

(1.中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；2.中国林业科学研究院林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091)

RHD3遗传互作因子突变体rren108的表型观察及遗传学分析

杨 亚1，2，袁德义1，范晓明1，李建波2，卢孟柱1，2，陈 军2

(1.中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；2.中国林业科学研究院林业研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091)

根毛是植物吸收水分和养料的的重要器官，研究与根毛生长发育调控相关的基因对培育优良经济林树种具有重要意义。作为模式植物，拟南芥是一种理想的根毛研究材料。RHD3基因的主要作用在于维持根毛的顶端生长，对内质网的正常形态的维持也有重要作用。但目前对于rhd3 突变体中引起根毛及内质网缺陷的机理还不是十分清楚。目前对于rhd3 突变体中引起根毛及内质网缺陷的机理还尚未清楚。该研究试图通过分析对比野生型拟南芥WT、rhd3-1：GFP-HDEL及rren108双突变体根毛及细胞内质网形态，探讨RHD3调控根毛的遗传互作因子及作用机理。表型统计结果表明：rren108的平均根毛长度与rhd3-1的根毛长度差异不大，但平均根毛密度仅为rhd3-1突变体的29.5％。且rren108的根毛分布不均匀，根毛形态也发生了变异。进一步遗传分析表明，该突变性状受一对隐性单基因控制。对rhd3-1：GFP-HDEL及rren108的细胞内质网的观察表明，rren108的内质网的连接点较rhd3-1少，且其管状结构变厚呈块状，暗示rren108可能通过参与细胞内质网结构控制根毛的。

拟南芥；突变体rren108；RHD3；根毛；内质网；表型观察；遗传学分析

根是植物生长发育的重要器官，是植物吸收水分和矿物质的主要部位。根系是体现植物生存能力的一个重要性状，理想的根系是植物生存并适应环境胁迫的有力保障[1-2]。除了主根和侧根外，根毛也是根系的重要组成部分，是根系吸收养料和水分最重要的部位。根毛不仅能够大大增加根系的表面积，大大增加植物根系对水分及矿物质的吸收能力，还能感应外部环境，与土壤共生菌相互作用，并固定植物[3-6]。健康的根毛是林木正常生长的重要保障。因此研究根毛生长发育调控的相关基因对培育优良经济林树种具有重要意义。

近年来，根毛的发育机理广受关注。作为一种模式植物，拟南芥为研究植物的生长发育、细胞生物及生理学提供了许多有用的信息。拟南芥作为根毛发育研究的基础，已经筛选和积累了大量的拟南芥根毛突变体，rhd3突变体就是其中一个。与野生型相比，rhd3突变体的根毛短且弯曲，根毛长度减少为野生型的三分之一，且根毛呈波浪状(图3b，c)。从rhd3 突变体的根毛表型可知，RHD3的主要作用在于维持根毛的顶端生长[7]。同时有研究表明，RHD3基因编码一种含有GTP酶结构域的蛋白质。该蛋白定位在内质网膜上，介导形成并维持内质网的网络状结构[8]。在野生型拟南芥细胞中，管状内质网形成纵横交错的多边形网状结构(图3d)。而在rhd3突变体的细胞中，内质网的管状结构及分叉都大量减少(图3d)。目前对于RHD3对内质网的形成中所起的作用以及rhd3突变体中引起根毛缺陷的机理还不十分清楚。在内质网形成正常形态结构的过程中，RHD3起着重要作用，但该过程并不只有RHD3发挥作用。为揭示与RHD3具有相互作用关系，共同维持根毛正常发育的基因，本文以拟南芥在rhd3突变体为遗传背景下经EMS诱导的得到的rren108突变体为材料，观察其根毛长度和根毛数量及内质网形态，探讨RHD3与该突变基因的相互关系，以期为RHD3作用机理的进一步调控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 拟南芥材料

哥伦比亚型野生型拟南芥WT(Col-0：:GFPHDEL)，突变体rhd3-1：GFP-HDEL，及rhd3-1：GFP-HDEL种子经甲基磺酸乙酯(EMS)处理后自交两代得到的根毛突变表型能稳定遗产的的突变体rren108，由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室提供。

1.2 突变体表型分析

将WT、rhd3-1及rren108种子先后用75％和100％的酒精灭菌和脱水后，分别播种于08％琼脂(w/v)的1/2MS培养基中。4℃黑暗冷藏2～4d再移至拟南芥培养室中发芽和培养，培养条件为(22±2)℃，光暗周期16h/8h，光照强度110umol·m-2s-1。5d后在体视镜下观察，分别统计30株WT、rhd3-1及rren108主根成熟区1.5mm内的根毛数量。同时拍照，用Image J软件测量根毛长度。

1.3 遗传分析

取至少200粒rren108与rhd3-1杂交获得的F2种子按上述方法培养7d后，分别统计突变型表型和rhd3-1表型植株的数量，进行χ2测验，按照孟德尔遗传规律对突变表型是否由单基因控制进行分析[9]。

1.4 细胞内质网形态观察

将野生型拟南芥Col-0：GFP-HDEL，rhd3-1：GFP-HDEL以及rren108在1/2MS培养基上培养1周后，分别取叶片在激光共聚焦显微镜下观察其细胞内质网的形态。

2 结果与分析

2.1 突变体根毛表型分析

野生型拟南芥WT，rhd3-1及rren108主根成熟区1.5mm内的根毛数量如图1。rhd3-1突变体的平均根毛长度明显较野生型拟南芥短，为93μm，仅为野生型拟南芥根毛长度的28.3％；rren108的平均根毛长度为101μm，与rhd3-1的根毛长度差异不大。从图2可知，rhd3-1突变体的平均根毛密度与野生型的相差不大，分别为48/1.5mm和50/1.5mm，与前人的研究结果基本一致[10]。而rren108的平均根毛密度为13/1.5mm，仅为rhd3-1平均根毛密度的29.5％。同时，rren108根毛分布不均匀，且形态也发生了变异(图3b，c)。

图1 拟南芥野生型WT，突变体rhd3-1和rren108主根成熟区1.5mm内根毛长度Fig.1 Root hair length of wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1 mutant and rren108 in taproot mature region within 1.5mm

2.2 突变体遗传分析

突变体rren108与rhd3-1杂交，F1代所有个体的表型都与rhd3-1一致，表明突变表型受隐性核基因控制。F1自花授粉所得的F2中根毛表型分离模式见表1，从表中可知，rhd3-1表型植株与根毛突变植株的分离比为95：265，卡方检测结果为0.542 80＜χ20.05，1=3.84，分离规律符合孟德尔单基因控制性状遗传分离规律，表明该突变性状是一个单隐性基因控制的数量性状[11]。

图2 拟南芥野生型WT，突变体rhd3-1和rren108主根成熟区1.5mm内根毛数量Fig.2 Root hair numbers of wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1 mutant and rren108 in taproot mature region within 1.5mm

图3 拟南芥野生型WT、突变体rhd3-1和rren108根毛及细胞内质网形态Fig.3 Root hairs and ER morphology wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1 mutant and rren108

表1 rren108 与 rhd3-1杂交F2植株分离Table 1 Segregation of F2 populations of rren108 crossed to rhd3-1

2.3 细胞内质网形态观察

rren108，rhd3-1：GFP-HDEL及WT Col-0：GFP-HDEL的内质网C末端融合GFP-HDEL蛋白，在477nm光波照射下，会发出稳定明亮的绿色荧光，能清晰地反映内质网的形态。rren108，rhd3-1及WT叶片细胞的内质网形态如图3d。与rhd3-1相比，rren108的内质网的连接点较少，存在一些不成型的多边形，且其管状结构变厚呈块状。

3 结论与讨论

拟南芥的根表皮细胞分生长成根毛(生毛细胞)和保持无毛的表皮细胞(非生毛细胞)[12]。一般情况下，位于两个皮层细胞连接处下方的表皮细胞发育成生毛细胞，而位于一个皮层细胞的正下方的表皮细胞发育成非生毛细胞，这种表皮细胞根毛分布与皮层细胞的对应关系称为位置效应[13]。本研究中，rren108的根毛长度较rhd3-1的根毛长度相差不大，但其毛的平均密度明显较rhd3-1平均根毛密度小，且根毛分布不均匀。可能是由于rren108是影响调控根毛表皮细胞分化的基因，rren108的突变导致位于两个皮层细胞下方的生毛细胞命运发生改变，成为非生毛细胞。目前，在拟南芥中已经证实了一些根毛稀少的突变体。如CPC，TRY，ETC1，WER等MYB家族蛋白，是生毛细胞的正向调节因子[14-15]。这些基因的突变会促进拟南芥非生毛细胞的分化或抑制生毛细胞形成，导致根表皮细胞分化为根毛的频率变小。这些基因或者参与这一途径的基因的突变，都有可能导致根毛密度变小。

研究结果还表明，相对于rhd3-1，rren108突变体叶片细胞的内质网有一些不成型的多边形，且其管状结构变厚呈块状。细胞中的内质网是一个高度动态性的膜系统，其膜结构不断地进行融合和分裂。在成熟细胞中，内质网呈管状[16]，有着很高的膜弯曲度[17]。同时，管状的内质网之间还能通过膜的融合能形成管状内质网特有的“三向通道”(three-way junction)结构[18]。在野生型拟南芥的叶片细胞中，管状内质网形成纵横交错的多边形网状结构，延伸至细胞的各个角落。目前已有研究表明，RHD3是一种存在于管状内质网中的大G蛋白[19-21]，主要参与管状内质网的形成[8]。在拟南芥rhd3-1突变体中，管状连接点及分叉结构都大大减少。从rren108突变体细胞的内质网有一些不成型的多边形可以推测，rren108可能是影响内质网膜的融合相关的基因。同时，rren108内质网的管状结构呈块状，表明rren108可能同时也是影响膜弯曲度的基因。

总之，在拟南芥在rhd3突变体为遗传背景下的rren108突变体不仅根毛数量和根毛形态发生明显变化，其细胞内质网的形态也发生变异。表明RHD3与该突变基因共同作用，影响拟南芥根毛表型及细胞内质网形态，同时暗示rren108可能通过参与细胞内质网结构控制根毛的发生及形态变异。而RHD3与该突变基因具体的互作关系还在进一步研究中。

[1] 王 欢.拟南芥根毛异常突变体rhm的相关表型分析及其基因克隆[D].开封,河南大学,2012.

[2] 薛 立,傅静丹.影响植物竞争的因子[J]中南林业科技大学学报,2012.32(2)：6-15.

[3] Parker J,Cavell AC,DolanL,Roberts K,Grierson C.Genetic Interactions during Root Hair Morphogenesis in Arabidopsis [J].The Plant Cell,2000,12：1961-74.

[4] CardenasL.New Findings in the mechanisms regulating polar growth in root hairs [J].Plant signaling & behavior,2009,4(1)：4-8.

[5] 马华明,梁坤南,周再知,等.国药沉香结香真菌的分离鉴定及分析[J].中南林业科技大学学报,2012,32(7)：72-75.

[6 ] 周国英,何小燕.林木菌根对重金属的抗性及解毒机理的作用[J].经济林研究.2003,21(4)：117-119.

[7] Schiefelbein JW,Somerville C.Genetic control of root hair development in Arabidopsis thaliana [J].Plant Cell.,1990,2：235-43.

[8] Chen J,Stefano G,Brandizzi F,Zheng H.Arabidopsis RHD3 mediates the generation of the tubular ER network and is required for Golgi distribution and motility in plant cells [J].Journal of Cell Science,2011,124(13)：2241-2252.

[9] 丁沃娜,吴 晶,罗丽丽,等.水稻短根毛突变体ksrh1的遗传分析和基因定位[J].中国水稻学,2012,26(1)：1-4.

[10] Caitlin Doyle .Isolation and Characterization of Genetic Modifiers of Arabidopsis RHD3 [D].Department of Biology.McGill University.Montreal,Quebec,Canada.2012.

[11] 丁沃娜.水稻根毛发育调控基因OsRHL1的克隆及功能研究[D].杭州.浙江大学.2009.

[12] Schneider K,Wlls B,DolanL,Roberts K.Structural and genetic analysis of epidermal cell differentiation in Arabidopsis primary roots [J].Development,1997,124：1789-1798.

[13] 张麝龙.拟南芥根毛发育相关基因SRH1的功能和调控研究[D].杭州.浙江大学.2007.

[14] Bruex A,Kainkaryam RM,Wieckowski Y,Kang YH,Bernhardt C,et al.A gene regulatory network for root epidermis cell differentiation in Arabidopsis [J].PLoS Genet 2012,8：e1002446.

[15] Zhao H,Wang X,Zhu D,et al.A single amino acid substitution in a IIIF bHLH transcription factor AtMYC1 leads to trichome and root hair patterning defects by abolishing its interaction with partner proteins in Arabidopsis [J].Biology Chemistry：2012,14109-21.

[16] Ridge RW,Uozumi Y,Plazinski J,et al.Developmental transitions and dynamics of the cortical ER of Arabidopsis cells seen with green fl uorescent protein [J].Plant Cell Physiol.1999,40：1253-1261.

[17] Voeltz GK,Prinz WA,Shibata Y,et al.A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum [J].Cell.2006,124(3)：573-586.

[18] 隋学武,胡俊杰.内质网膜形态维持的分子机制[J].生命科学 .2011,23(11)：1081-1087.

[19] Wang H,Lockwood SK,Hoeltzel MF,et al.The ROOT HAIR DEFECTIVE3 gene encodes an evolutionarily conserved protein with GTP-binding motifs and is required for regulated cell enlargement in Arabidopsis [J].Genes Dev.1997.11,799-811.

[20] 宋 丹,乌云塔娜,包文泉,等.内蒙古野生山杏优良单株果实性状的遗传变异分析[J].经济林研究,2013,31(3)：1-9.

[21] 朱凤云,陈鸿鹏,谭晓风.油桐种子LOX基因的克隆与生物信息学分析[J].经济林研究,2013,31(2)：13-19.

Phenotypic and genetic characterization of a RHD3 genetic interactor mutant rren108

YANG Ya1,2,YUAN De-yi1,FAN Xiao-ming1,LI Jian-bo2,LU Meng-zhu1,2,CHEN Jun2
(1.Key Lab.of Non-wood Forest Nurturing and Protection of Chinese Education Ministry,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China; 2.State Key Lab.of Tree Genetics and Breeding,Research Institute of Forestry,Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091,China)

Root hairs are of great agronomic importance due to their essential roles on mineral and water uptaking in plants,therefore,searching for genes involved in root hair development and their corresponding regulatory mechanisms characterization have great potentials on breeding of non-wood forest cultivars and other plant species.As a well-studied model plant,Arabidopsis(Arabidopsis thaliana)bears a lot of advantages for root hair analysis.RHD3 was identi fi ed as an important root hair regulatory player in Arabidopsis and was found to affect the root hair morphology by root hair tip growth regulation,which is also associated with defects in ER morphology.The seeds of at present,the mechanism of causing induced hairs and endoplasmic reticulum defect in rhd3 mutants is not very clear.The study intends to compare and analyze the differences of root hair and cell endoplasmic reticulum among wild Arabidopsis thaliana WT,Arabidopsis rhd3-1：GFP-HDEL mutant and rren108,further explores the genetic interaction factors and interaction mechanism of RHD3 regulation to root hairs.The seeds of Arabidopsis rhd3-1：GFP-HDEL mutant were treated with Ethyl Methane Sulfonate(EMS)and an stable double mutation line rren108 was obtained.The phenotypic statistical results show that the average length of root hairs of rren108 seedlings was comparable to that of rhd3-1,but the root hair density in rren108 seedlings reduced to 29.5％compared to that of rhd3-1; The root hairs of rren108 were also abnormal both in morphology and distribution.The genetic analysis reveals that the root hair phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene.The examination of the ER morphology indicates that the connection points of the endoplasmic reticulum in rren108 mutants were less than that of rhd3-1 mutants,and the rren108 mutants’ tubular structure became thickened and showed a blocky state,revealing that the rren108 mutants may control the occurrence of root hair through endoplasmic reticulum structure.

Arabidopsis thaliana; mutant rren108; RHD3; root hair; endoplasmic reticulum; phenotypic observation; genetic analysis

S718.46

A

1673-923X(2015)07-0110-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.07.020

2014-10-10

国家高技术研究发展计划(2013AA102702)

杨 亚，硕士研究生

陈 军，副研究员，博士；E-mail：chenjun@caf.ac.cn

杨 亚，袁德义，范晓明，等.RHD3遗传互作因子突变体rren108的表型观察及遗传学分析[J].中南林业科技大学学报,2015,35(7)：110-114.

[本文编校：吴 毅]