QuEChERS—UPLC—MS/MS法同时测定羊奶中8种β－内酰胺类抗生素

王帅帅郑小平孟 瑾何亚斌

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海必诺检测技术服务有限公司，上海 200436）

羊奶营养丰富、易于吸收，其蛋白质和脂肪含量均高于牛奶，被国际营养学界称为“奶中之王”［1］。在中国奶类产量中，山羊奶是第二大奶类，中国已成为饲养奶山羊最多的国家［2］。β－内酰胺类抗生素可以治疗奶羊乳腺炎、心包炎等疾病，在奶羊养殖过程中，由于缺乏科学用药的知识，或受经济利益的驱使，不合理用药现象仍很严重［3］。长期食用含有β－内酰胺类抗生素的羊乳会引起疾病，如过敏反应、致畸反应以及增加细菌的耐药性［4］。

目前，国内外关于羊奶中β－内酰胺类抗生素的检测报道较少［5］，牛奶中β－内酰胺类抗生素的测定多采用传统的固相萃取法（SPE）净化样品［6－9］，与传统的固相萃取净化法相比，QuEChERS净化法具有样品前处理时间短、节省溶剂、降低检测成本等优点。本研究拟在参考牛奶中β－内酰胺类抗生素检测 方 法［10－13］的 基 础 上，用 改进 的 QuEChERS 净 化法［14］，结合超高效液相色谱串联质谱法（UPLC—MS/MS）测定羊奶中8种β－内酰胺类抗生素。试验以乙腈为提取试剂，C18和PSA吸附剂净化处理，具体考察提取试剂、吸附剂类别和用量等条件对回收率的影响。以期为羊奶中β－内酰胺类抗生素的检测提供一种快速、可靠的检测方法，同时对相关标准的制定亦具有指导意义。羊奶中蛋白质和脂肪的含量与牛奶中相差不大，本方法也适用于牛奶中β－内酰胺类抗生素的测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱—串联质谱仪：Waters XEVO TQ型，ESI源，美国沃特世公司；

高速冷冻离心机：Heraeus Multifuge X1R型，美国热电公司；

氮吹仪：ANPEL DC12型，上海安谱科学仪器有限公司；

超声波仪：TH型，上海安谱科学仪器有限公司。

乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

甲酸：分析纯，美国Sigma公司；

C18粉、PSA吸附剂：天津博纳艾杰尔科技有限公司；

标准品：阿莫西林、头孢喹肟、头孢氨苄、氨苄西林、头孢噻呋、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林，纯度＞98.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

羊奶：市售。

1.2 标准溶液配制

（1）标准储备溶液：分别准确称取8种标准品各10mg，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得1.0mg/mL的标准储备液，低温储存备用。

（2）混合标准储备液：吸取8种标准储备液各100μL，用50%乙腈水溶液溶解并定容至10mL，即得10μg/mL的混合标准储备液。

（3）标准工作溶液：用50%乙腈水溶液逐级稀释混合标准储备液。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取 称取5.00g羊奶于50mL离心管中，加入乙腈10mL，涡旋振荡1min，超声提取10min，8 000r/min离心5min，上清液待净化。

1.3.2 净化 取1.3.1中上清液8mL转移至15mL离心管中（管中预先加入150mg C18和150mg PSA），涡旋混匀1 min，5 000r/min离心3min，取6mL上清液氮气吹干，残渣用1mL 10%乙腈水溶液复溶，过0.22μm有机相滤膜，上机分析。

1.4 分析条件

1.4.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM C18（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；柱温30℃；流动相梯度洗脱程序：0～1min，95%A，1～4min，95%～50%A，4～6min，50%A，6～7min，50%～95%A，7～8min，95%A，进样量：5 μL，流速：0.3mL/min。

1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；毛细管电压：1.60kV；离子源温度：150℃；去溶剂温度：500℃；去溶剂气流：氮气，800L/h；碰撞气：氩气；多反映监测模式（MRM）采集。8种β－内酰胺类抗生素的保留时间、母离子、子离子以及对应的碰撞能量见表1。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

测定牛奶中β－内酰胺类抗生素时通常使用甲醇/0.1%甲酸水溶液或乙腈/0.1%甲酸水溶液作流动相，本试验比较了这两种流动相对8种β－内酰胺类抗生素色谱行为的影响。结果表明，以甲醇/0.1%甲酸水溶液为流动相时，5种青霉素类化合物响应值较低，峰形较差，以乙腈/0.1%甲酸—水溶液为流动相时，8种目标化合物分离完全，且峰形较好，故选用乙腈/0.1%甲酸水溶液为流动相，8种β－内酰胺类抗生素的总离子流图见图1。

表1 8种β－内酰胺类抗生素质谱条件Table 1 MS parameters of 8β-lactams

图1 8种β－内酰胺类抗生素总离子流图Figure 1 Total ion chromatogram （TIC）of 8β-lactams

2.2 样品处理条件的选择与优化

2.2.1 提取试剂的选择 试验比较了甲醇、乙腈、1%甲酸乙腈3种提取试剂对待测组分回收率的影响，结果见图2。由图2可知，乙腈去蛋白的能力较强，提取效果最好，甲醇中的羟基会加速青霉素的分解，酸性条件下，头孢类抗生素的提取效果比青霉素类抗生素好，综合考虑，选择乙腈作为提取试剂。

2.2.2 吸附剂对净化效果的影响 试验比较了C18、PSA和C18＋PSA（1＋1）3种净化方式对回收率的影响，结果见图3。由图3可知，C18＋PSA（1＋1）混合使用比单独使用净化效果好，这是由于C18主要吸附样品中的脂肪和蛋白，PSA主要吸附样品中的脂肪酸和糖类杂质，单独使用C18或PSA时，样品中脂肪和蛋白吸附不完全，存在较大的基质效应，综合考虑，选择C18＋PSA净化方式净化样品。

2.2.3 C18＋PSA（1＋1）吸附剂用量对净化效果的影响 试验优化了C18＋PSA（1＋1）吸附方式的不同用量对8种β－内酰胺类抗生素的净化效果，结果见图4。由图4可知，当C18＋PSA吸附剂为300mg时，各组分的回收率最高。吸附剂用量为100mg时，样品中蛋白和脂肪吸附不完全，吸附剂用量为500mg时，吸附剂会吸附样品中目标化合物，导致回收率降低，综合考虑，选择吸附剂用量为300mg。

图2 提取试剂对提取效果的影响Figure 2 Effect of extraction reagent on extraction efficiency

图3 吸附剂对净化效果的影响Figure 3 Effect of different sorbents on extraction efficiency

图4 C18＋PSA用量对净化效果的影响Figure 4 Effect of weight of C18and PSA on extraction efficiency

2.3 线性范围和方法检出限

用空白样品提取液配制系列标准曲线，标准曲线浓度分别为1.0，5.0，10.0，25.0，50.0μg/kg。按1.3的方法处理测定，测定后以各组分的峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg/kg）为横坐标，绘制标准曲线，以信噪比S/N≥3确定方法的检出限（LOD），以信噪比S/N≥10确定方法的定量限（LOQ），8种β－内酰胺类抗生素的方法检出限为0.25～1.00μg/kg，定量限为1.0～2.0μg/kg。在1.0～50.0μg/kg浓度范围内，8种目标化合物的线性方程、相关系数、方法检出限和定量限见表2。

表2 各化合物的线性方程及方法检出限Table 2 Linear equations and correlation coefficients

2.4 方法回收率和精密度

用同一空白羊奶样品做加标回收试验，8种β－内酰胺类抗生素的添加水平分别设定为5.0，10.0，25.0μg/kg。按照1.3的方法进行测定，每个添加水平做6个平行样，结果见表3。

表3 8种β－内酰胺类抗生素的回收率和精密度Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of 8β-lactams in spiked milk samples（n＝6）

2.5 实际样品的测定

应用本方法对15份市售的羊奶进行检测，按1.3中样品处理方法操作，各样品中均未检测到8种β－内酰胺类抗生素的残留，说明测定的15份羊奶质量较好。

3 结语

本试验建立了QuEChERS净化法结合超高效液相色谱串联质谱法测定羊奶中8种β－内酰胺类抗生素的方法，该方法使用吸附剂直接净化样品，与传统固相萃取净化相比，该方法样品前处理简单快速、提高了检测效率，同时也具有较好的回收率和较低的检出限，方法实用性较强，为羊奶及其他奶制品中β－内酰胺类抗生素的残留检测提供了可靠的方法，对相关标准的制定也具有指导性意义。

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