贮存条件对Gairdner大麦和麦芽的醛类物质的影响

2015-12-20郝俊光陈华磊杨理章张源麟董建军

食品工业科技 2015年4期

郝俊光，闫　鹏，陈华磊，杨理章，张源麟，尹　花，董建军，樊　伟，，*，陆　健

（1.啤酒生物发酵工程国家重点实验室，山东青岛266100；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；3.贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司，贵州遵义563000；4.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

郝俊光1，闫鹏1，陈华磊1，杨理章2，3，张源麟4，尹花1，董建军1，樊伟1，2，*，陆健2

利用固相微萃取与气相色谱-质谱联用检测醛类物质的方法跟踪了啤酒酿造大麦和麦芽Gairdner中的脂质氧化醛、Strecker醛、糠醛在10℃和35℃条件下的变化趋势。新鲜麦芽中的Strecker醛和糠醛含量高于大麦，而脂肪氧化醛含量和脂合氧化酶活力明显低于大麦。大麦和麦芽中脂质氧化醛和糠醛在贮存过程明显增加，具有指示大麦和麦芽新鲜度的可能性。10℃和35℃贮存5个月后，大麦的反-2-壬烯醛分别增加了1.01和1.62倍，而麦芽的反-2-壬烯醛分别增加5.12和17.74倍。由于反-2-壬烯醛的高风味活性特点，建议将反-2-壬烯醛作为大麦和麦芽新鲜度与品质优劣的关键性评价指标。本研究从脂质氧化醛等指标量化的角度，再次肯定了低温贮存相对于高温贮存更利于大麦和麦芽保持新鲜的事实。

大麦，麦芽，醛，新鲜度，反-2壬烯醛，贮存

如何提高啤酒风味稳定性即延长啤酒新鲜度一直是酿酒师面对的共同难题[1]。与啤酒新鲜度相关的物质和反应机理很多，且风味物质之间相互促进或抑制，使啤酒新鲜度问题变得极为复杂[2-3]。Saison归纳出50余种与啤酒老化直接相关的物质，涉及美拉德反应、脂类降解、氨基酸Strecker降解、高级醇氧化、醛醇缩合等老化途径[4]。其中，醛类尤其是脂质氧化产生的醛（反-2-壬烯醛、己醛、戊醛）、美拉德热反应产生的醛（糠醛）和氨基酸降解产生的醛（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯乙醛）是公认的啤酒老化风味物质[2-5]。

作为啤酒的主要原料，啤酒麦芽的质量及新鲜度直接影响啤酒的质量和风味稳定性[1，6-7]。麦汁反-2-壬烯醛已被证实与啤酒的老化趋势有很好的相关性，所以降低麦芽脂质氧化醛尤其是反-2-壬烯醛的量对于提高啤酒的新鲜度非常关键[1，8]。同时，Jeroen认为使用不当的麦芽，可以造成啤酒因Strecker醛的含量过高而容易老化[3]。通常认为麦芽对啤酒风味稳定性的影响是双重的，主要是因为麦芽中抗氧化成分（多酚类和还原性酶等）和促氧化成分（脂氧合酶、羟基脂肪酸等）共存[9-12]。

研究表明，原料贮存过程中脂肪酸的酶促氧化、非酶促氧化是造成原料新鲜度降低的直接原因，而选择低脂肪酸氧合酶（LOX）活力、新鲜度高的原料是生产高风味稳定性啤酒的基础[1，6，9，13]。目前，在啤酒酿造企业中，对于麦芽新鲜度的判定，除感官品评外，无有效的技术手段。同时，国内外关于直接检测大麦和麦芽中醛类物质报道较少，尚无醛类物质在贮存过程中变化规律和在新鲜度判定应用的报道[6，14-16]。本研究利用邻-五氟苄基羟胺（PFBHA）顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）技术自行开发的啤酒原料中醛类物质的定量检测方法，对大麦和麦芽在两种模拟贮存条件下脂质氧化醛、Strecker醛和糠醛的变化进行跟踪，从脂质氧化、氨基酸Strecker降解和美拉德反应三种老化途径阐明大麦和麦芽老化的物质变化规律。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大麦Gairdner、麦芽Gairdner 青岛啤酒麦芽厂；65μm聚二甲基硅烷/二乙烯苯（PDMS/DVB）萃取纤维头美国Supelco公司；2-甲基丙醛（99%）、2-甲基丁醛（95%）、3-甲基丁醛（97%）、戊醛（97%）、己醛（98%）、糠醛（99%）、苯乙醛（90%）、反-2-壬烯醛（97%）、邻-五氟苄基羟胺（PFBHA，98%）Sigma公司。

Clarus600 GC-MS美国PerkinElmer公司；HP-5ms（60m×0.32mm×0.25μm）色谱柱美国Agilent公司；固相微萃取自动进样器瑞士CTC公司；Cyclotec1093Sample Mill型旋风磨瑞士Tecator公司；Milli-Q超纯水系统法国Millipore公司。

1.2实验方法

1.2.1大麦和麦芽的贮存实验大麦Gairdner和麦芽Gairdner用布袋分装，放置在10℃（相对湿度60%）和35℃（相对湿度75%）的人工气候箱贮存，贮存2、3、4、5个月并进行醛类指标和LOX活力的测定。

1.2.2醛类物质的检测

1.2.2.1固相衍生萃取方法大麦或麦芽用旋风磨粉碎三次，过120目筛，取0.1g大麦或麦芽粉末到20mL顶空瓶内，旋紧顶空瓶盖。顶空衍生固相微萃取由自动进样器自动完成，先将PDMS/DVB固相微萃取纤维插入装有10mL浓度为60mg/L的PFBHA溶液20mL顶空瓶的顶空中吸附衍生试剂20min，然后将吸附有PFBHA的纤维插入装有大麦或麦芽样品顶空瓶的顶空中40℃衍生萃取80min，最后纤维头移入气相色谱进样口在250℃下解吸2min。

1.2.2.2GC-MS色谱条件色谱柱HP-5ms；载气为氦气，流速1.5mL/min；进样口温度250℃，不分流进样；程序升温：40℃保温2min，以10℃/min升到140℃，以7℃/min升到250℃，250℃保温3min。

1.2.2.3GC-MS质谱条件电子轰击（EI）离子源，电子能量70eV；GC-MS接口温度250℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；Scan的扫描范围：40～500amu。采用标准品的PFBHA衍生产物进行定性，采用选择离子（181m/z）扫描进行定量[5]。

1.2.2.4醛类物质标准曲线的制作往顶空瓶内0.1g样品加入5μL用无水乙醇溶解的不同浓度的标准品作为标准曲线的不同梯度，以加入5μL无水乙醇而不加标的样品为空白，分别检测。将每个梯度的醛类物质的定量离子的峰面积分别扣除空白醛类的峰面积作为y，加标量为x，绘制强制过原点的标准曲线。

1.2.2.5样品中醛类物质的定量往顶空瓶内0.1g样品中加入5μL无水乙醇，密闭，上机检测，将各醛定量离子的峰面积带入对应的标准曲线进行定量。

1.2.3大麦和麦芽的脂氧合酶LOX活力检测

1.2.3.1大麦和麦芽中脂氧合酶LOX的提取取50.0g大麦或麦芽粉碎后，准确称取0.5g待测样品加入pH5.0的0.1mol/L醋酸缓冲液溶液5mL，混匀后在4℃提取15min，之后12000r/min离心20min，取上清液低温贮存备用。

1.2.3.2LOX活力的测定分光光度计法[9]，结果以比酶活力的形式表示。

1.2.4麦芽的品评采用协定法糖化制备麦芽汁，降温至15℃后保温10min后进行品评。麦芽的品评实验由青岛啤酒5名评委进行评价，品评标准见表1。

表1　麦芽品评标准Table.1　Sensory evaluation of wort

2　结果与讨论

2.1大麦与麦芽贮存过程中脂肪氧化酶（LOX）活力的变化

国外研究表明，LOX对大麦和麦芽的脂质氧化醛通过酶促途径的生成有显著的影响[2-3，6，10，14]，故本研究对大麦和麦芽贮存过程的LOX活力变化进行了跟踪。新鲜Gairdner大麦的LOX活力大于66.25U·g-1，大于新鲜Gairdner麦芽LOX活力6.09U·g-1，其原因主要是制麦焙焦的加热过程造成大量LOX酶的失活[9]。

Gairdner大麦和麦芽的脂肪氧化酶活力都随贮存时间的延长逐渐下降，分别见图1和图2。10℃贮存5个月后，大麦的LOX下降了42.08U·g-1、降幅63.5%，麦芽下降了3.71U·g-1、降幅60.9%；35℃贮存5个月时，大麦的LOX下降了47.77U·g-1，降幅72.1%，麦芽下降了5.89U·g-1，降幅96.7%。很明显，35℃贮存条件下的LOX活力下降较10℃贮存快，但这不意味着高温贮存更利于保持麦芽的新鲜度，因为LOX的最适作用温度为37℃，而35℃贮存条件更接近于LOX最适作用温度[13]。

图1　Gairdner大麦在贮存过程中LOX的变化Fig.1　The changes of LOX activity of Gairdner barley during storage

图2　Gairdner麦芽在贮存过程中LOX的变化Fig.2　The changes of LOX activity of Gairdner malt during storage

2.2大麦与麦芽贮存过程中醛类物质的变化

2.2.1新鲜大麦和麦芽醛类分布的差异醛类物质是麦芽的主要风味物质，同时也是啤酒中不良风味物质的主要来源。新鲜Gairdner大麦和麦芽的醛类物质分布有较大差别，如图3所示。麦芽中的Strecker醛和糠醛含量高于大麦，而脂肪氧化醛明显低于大麦。主要原因可能是麦芽在发芽过程中产生氨基酸会在麦芽焙焦时发生Strecker降解而生成2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和苯乙醛，它们分别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的高温降解产物；糠醛是美拉德反应的一种产物，主要在制麦的焙焦阶段由葡萄糖和氨基酸反应生成；制麦过程尤其是发芽阶段发生的复杂生化反应可能是导致戊醛、己醛和反-2-壬烯醛较大麦低的直接原因[2-3，7]。

2.2.2大麦贮存过程中醛类物质的变化跟踪了Gairdner大麦在10℃（相对湿度60%）、35℃（相对湿度75%）贮存过程中醛类物质的变化情况，详见表2。在不同贮存条件下，大麦的脂质氧化醛类物质都增加，在10℃5个月贮存条件下戊醛、己醛和反-2-壬烯醛分别增加了0.90、0.82、1.01倍，而在35℃贮存条件下戊醛、己醛和反-2-壬烯醛分别增加了1.35、1.58、1.62倍。在同一贮存条件下，脂质氧化醛增幅均较大，表明贮存过程中脂类氧化比氨基酸降解、美拉德反应更为强烈。脂质氧化醛在贮存过程中的明显增加，应该是脂肪降解出的不饱和脂肪酸尤其是油酸和亚油酸发生酶促和非酶促氧化共同作用的结果[2，7，13，17]。在35℃贮存条件下反-2-壬烯醛的增加量明显高于10℃，这一结果与35℃更接近于LOX最适温度从而促进了脂肪酸的酶促氧化反应以及35℃较10℃更利于脂肪酸的非酶促氧化直接相关[8-9，13]。

图3　新鲜Gairdner大麦和麦芽的醛类分布差异Fig.3　The different distribution of aldehydes between fresh barley and malt of Gairdner

2.2.3麦芽贮存过程中醛类物质的变化跟踪了Gairdner麦芽在10℃（相对湿度60%）、35℃（相对湿度75%）贮存过程中醛类物质的变化情况，详见表3。新鲜麦芽中Strecker醛（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛和苯乙醛）含量较高，2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛在贮存过程中呈下降趋势，且在35℃贮存条件下降低的幅度明显大于10℃，这或许与这些醛的高挥发性有关。由于3-甲基丁醛具有麦香味，是麦芽风味的重要组成物质之一，其含量在贮存过程减少体现出麦芽品质的降低。与其他Strecker醛不同，苯乙醛在2个月时含量最低，此后略有增加，但相同贮存时间下35℃贮存的含量明显低于10℃。贮存过程中麦芽的糠醛含量升高，35℃贮存5个月的糠醛含量是10℃贮存的1.80倍，这与美拉德反应随着温度的升高反应加速有关[2]。脂质氧化醛在贮存过程中增加明显，在10℃5个月贮存条件下戊醛、己醛和反-2-壬烯醛分别增加了2.83、0.70、5.12倍，在35℃贮存条件下则分别增加了3.06、1.33、17.74倍，这一结果表明麦芽在35℃贮存更利于不饱和脂肪酸的酶促和非酶促氧化反应[8-9，13]。品评结果（见表3）表明，麦芽在10℃贮存5个月时才因出现氧化味被评为Ⅱ档，而麦芽在35℃贮存第二个月即因出现氧化味被评为Ⅱ档、35℃贮存三个月及以上则因氧化味明显和麦香味下降而评为Ⅲ档，这一品评结果与脂质氧化醛增加、Strecker醛下降有明显的相关性。

表2　Gairdner大麦在贮存过程中醛类物质的含量变化（μg·kg-1）Table.2　The changes of aldehydes content in Gairdner barley during storage（μg·kg-1）

表3　Gairdner麦芽在贮存过程中醛类物质的含量变化（μg·kg-1）Table.3　The changes of aldehydes content in Gairdner malt following storage（μg·kg-1）

2.2.4大麦和麦芽贮存35℃5个月后醛类物质的差异大麦和麦芽醛类物质贮存5个月的结果，可以反映出实际生产过程中大麦和麦芽在极端条件下（高温、高湿）醛类的变化趋势，并揭示大麦和麦芽随贮存而新鲜度和品质下降的原因。大麦和麦芽在35℃贮存5个月后的醛类分布明显不同（见表2、表3）。大麦中的脂质氧化醛尤其是反-2-壬烯醛明显高于对应的麦芽，应该与相同贮存条件下大麦中LOX明显高于麦芽中的活力有一定的关系；麦芽中Strecker醛除苯乙醛外在贮存过程中虽发生明显的下降，但仍显著高于对应的大麦。可以推断，麦芽中风味物质3-甲基丁醛等的下降及己醛、反-2-壬烯醛的上升是麦芽贮存过程品质和新鲜度下降的直接体现。啤酒中脂质氧化醛中的反-2-壬烯醛含量高会对啤酒新鲜度造成影响、引发纸板味已是业内的共识，基于目前对麦芽新鲜度的评价尚缺乏精确的手段，作者认为通过醛类物质尤其是脂质氧化醛的检测对大麦、麦芽新鲜度进行精确评价是存在可能的。

3　结论

Strecker醛、脂质氧化醛和糠醛是大麦和麦芽的主要风味物质，脂质氧化醛和美拉德反应产物糠醛随着贮存时间的推移而增加明显，具有潜在指示大麦和麦芽新鲜度的可能。由于反-2-壬烯醛的高风味活性特点及对啤酒新鲜度影响的高相关性，建议将反-2-壬烯醛作为大麦与麦芽新鲜度和品质优劣的评价性指标。本研究表明，在高温（35℃）贮存条件下脂质氧化醛的含量均高于对应贮存时间时低温（10℃）贮存的含量，可能是低温贮存因偏离了LOX作用的最适温度而降低了脂肪酸酶促氧化速度及低温自身不利于脂肪酸的自氧化的发生而共同导致了高低温贮存醛类物质分布和新鲜度的差异，明确了低温贮存更利于原料新鲜度保持的原因。麦芽中除苯乙醛以外的Strecker醛在高温贮存过程中呈明显的下降趋势是值得进一步关注现象，而Strecker醛在麦芽贮存过程的下降可能是麦芽品质下降的一个重要表现，至于其与麦芽新鲜度的对应性需要进一步确认。本研究从醛类物质变化角度，解释了低温贮存更利于原料新鲜度保持的原因。

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Influence of storage conditions on the formation of aldehydes during barley and malt aging

HAO Jun-guang1，YAN Peng1，CHEN Hua-lei1，YANG Li-zhang2，3，ZHANG Yuan-lin4，YIN Hua1，DONG Jian-jun1，FAN Wei1，2，*，LU Jian2
（1.State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer，Technical Center of Tsingtao Brewery Co.，Ltd.，Qingdao 266100，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Kweichow Montai Co.，Ltd.，Zunyi 563000，China；4.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The changes of oxidation aldehydes of lipid，Strecker aldehydes and furfural of barley and malt Gairdner，during storage at 10 and 35℃，were investigated by solid phase micro-extraction（SPME）combined with GCMS.Comparing with fresh barley，Strecker aldehydes and furfural of fresh malt were higher，while contents of oxidation aldehydes of lipid and enzyme activity of lipoxygenase were lower.As both furfural and oxidation aldehydes of barley and malt increased distinguishedly，they are promising indicator to be used to evaluate fresh degree of barley and malt.After five months storage at 10℃and 35℃，comparing to fresh counterpart，trans-2-noneal concentration of barley increased 1.01 and 1.62 times，while trans-2-noneal concentration of malt increased 5.12 and 17.74 times，respectively.Taking its high flavor activity into account，trans-2-noneal was considered to be the most potential indicator to evaluate barley and malt quality and freshness degree. Based on aldehydes data in this paper，it verified the fact again that the importance effect of lower storage temperature to the freshness degree of barley and malt.

barley；malt；aldehydes；fresh degree；trans-2-nonenal；storage

TS201.1

1002-0306（2015）04-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.032

2014－05－06

郝俊光（1971-），男，博士，研究员，研究方向：啤酒酿造关键技术和风味调控技术。

樊伟（1959-），男，硕士，研究员，研究方向：啤酒酿造科学与应用工程。

啤酒用新酶创制与低碳制造关键技术研究（2013AA102109）。