大承气冲剂对腹腔感染致急性肺损伤患者巨噬细胞的作用

2015-12-20解基良闫瑞鹏张兴洲桑伟岗

中国中西医结合外科杂志 2015年6期

宋　媛，解基良，张　楠，单　涛，闫瑞鹏，张兴洲，桑伟岗

宋媛，解基良，张楠，单涛，闫瑞鹏，张兴洲，桑伟岗

目的：研究大承气冲剂对腹腔感染致急性肺损伤（ALI）患者肺泡巨噬细胞（AMs）的影响。方法：观察严重腹腔感染合并ALI成年患者60例，随机分为中药组(30例)和对照组（30例），对照组给予西医常规治疗合用安慰剂，中药组给予西医常规治疗合用大承气冲剂，疗程为5 d，分别于第1、3、5 d记录患者排气排便时间、尿乳果糖/甘露醇比值（尿L/M）、氧合指数（OI），并采集肺泡灌洗液，利用流式细胞仪定量检测肺泡灌洗液中AMs水平及其亚型M1、M2的百分比。结果：中药组和对照组尿L/M值均随时间延长下降，第5 d分别为3.97±1.53，7.01±2.44，中药组患者较对照组下降更明显(P＜0.05)；第5 d中药组和对照组OI分别为255.44±18.18，222.76±15.15，中药组明显升高(P＜0.05)。在两组患者随治疗进展腹腔感染所致肠功能障碍与ALI严重程度不断减轻的同时，中药组其肠功能、肺功能改善的程度优于对照组，且有明显的差异（P＜0.05）。比较治疗5 d后两组患者数据，AMs百分比分别为（92.65±1.06）%和（94.82±0.90）%，M1百分比为（42.17±6.99）%和（55.49±6.26）%，中药组均较对照组明显降低(P＜0.05)，M2百分比则为（44.72±5.36）%，（35.09±7.37）%，中药组患者较对照组明显升高（P＜0.05）。各组内AMs、M1及M2比例随肠功能、肺功能改善而分别见回落及升高趋势，均充分提示了AMs水平、M1比例下降及M2升高在严重腹腔感染合并ALI患者病理生理过程中的重要作用。结论：在腹腔感染致ALI的早期，应用大承气冲剂可有效减少AMs激活、聚集，降低M1比例，促进M2生成，从而减轻炎症反应，减轻肺损伤，保护肠黏膜屏障功能。

大承气冲剂，腹腔感染，急性肺损伤，肺巨噬细胞

严重的腹腔感染致急性肺损伤（acute lung injury，ALI），具备发病急，病情进展迅速，病死率高的特点。其病理形成机制大致为肠道功能抑制，肠屏障功能受损，肠道内细菌及内毒素移位，持续刺激免疫系统，使包括巨噬细胞在内的各种炎性细胞被激活，炎症介质大量释放；促炎反应和抗炎反应互相激化，引起自身破坏性的免疫失调，加重了肠组织缺血/再灌注损伤，最终导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的发生[1-2]。而腹腔感染引发肠外器官组织损伤，临床其中最常见，也最早发生功能障碍的靶器官即是肺。肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞损伤，弥漫性肺泡-毛细血管膜通透性增加，包括肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs）在内的各种炎症细胞聚集、活化并释放炎性细胞因子，造成非心源性肺水肿及微肺不张，最终导致ALI，甚至出现急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。AMs是肺部防御病原微生物和肺损伤的第一道防线,是肺部的主要炎症细胞,在腹腔感染合并ALI的发病过程中扮演着至关重要的角色，包括两种亚型：M1（典型性激活状态巨噬细胞）和M2（选择性激活状态巨噬细胞）。故我们的研究进一步观察大承气冲剂对腹腔感染合并ALI患者AMs的影响，对于防治和处理此类疾病具有一定的意义。

1　资料与方法

1.1一般资料所研究对象均为天津市南开医院SICU 2012年1月—2014年3月收治的符合下列筛选标准的腹腔感染合并ALI/ARDS患者。筛选标准：（1）腹腔感染符合脓毒症诊断标准（2001年华盛顿诊断标准）及肠功能障碍诊断（我国1995年重修MODS病情分期诊断及严重程度评分标准）。（2）ALI的诊断仍沿用1994年欧美联席会议提出的标准：①急性起病,存在致病因素。②氧合指数(动脉血氧分压/吸入氧浓度，PaO2/FiO2)＜300 mmHg(1 mmHg= 0.133 kPa)不参考呼气末正压(positive end expiratory pressure，PEEP)水平。③正位X线胸片显示双肺均有斑片状阴影。④肺动脉嵌顿压＜18 mmHg，或临床除外心源性因素。（3）其他纳入条件：①年龄＞18岁同时＜75岁；②急性生理学及慢性健康状态评分-II（APACHE-II）≥6分；③知情同意。（4）以下不符合排除标准的：①腹部外科危重病发病24 h内死亡者；②慢性腹部外科危重病的临终状态；③合并妊娠、外伤、免疫缺陷性疾患、乙肝表面抗原阳性、严重心血管疾病、终末期肝肾疾病、恶性肿瘤；④近3月内使用激素或免疫抑制剂；⑤各种原因中途退出者。筛选出满足以上条件的病例共60例，其中急性坏死性胰腺炎15例，消化道穿孔4例，急性化脓性阑尾炎伴阑尾周围脓肿7例，急性坏疽性胆囊炎伴胆囊穿孔6例，急性梗阻性化脓性胆管炎15例，复杂性不全性肠梗阻9例，胃肠术后肠瘘4例。采用随机数字表法随机分组，将患者分为中药组（30例）与对照组（30例）。两组均予基础治疗，包括吸氧、心电监护、镇痛、纠正休克、维持水电解质平衡、禁食、胃肠减压、抑制胃酸、抗感染等。中药治疗组采用大承气冲剂(药物组成：大黄，芒硝，厚朴，枳实，由南开医院制剂室提供)6 g(2袋)/次，3次/d，以100 mL温开水冲溶，对照组予等量形态相似无任何药效的安慰剂，口服或经胃管注入，第1至5 d连续服用。疗程为5 d。中药组与对照组内进行实验的严重腹腔感染患者的性别，年龄及入组时APACHEⅡ评分等资料不具有统计学意义（P＞0.05）。见表1。

1.2研究方法

1.2.1实验试剂及器材纤维支气管镜（Olympus-BF-P30），流式细胞仪（FACSCalibur，BD，美国），台式热电离心机（Thermo ST16R），200目过滤铜网等，AntihumanSR-AI/MSR1APC，即 CD204APC（R&D Systems Inc.），Anti human CD68-PE（BioLegend），FITC Mouse Anti-Human CD86、Fixation and Permeabilization Solution、Perm/Wash Buffer 10X solution(均为BD Biosciences生产)。

表1　两组一般资料观察比较（±s）

组别中药组对照组n 30 30性别（男/女）15/15 16/14年龄（岁）56±12 57±13 APACHEⅡ14.80±1.71 14.93±1.36

1.2.2检测指标与方法

1.2.2.1标本采集筛选后第1、3、5 d晨起8:00取肺泡灌洗液5 mL，并记录OI数值、排气排便时间。按照中华医学会2002年《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范》对患者行支气管肺泡灌洗术。具体采集流程如下：（1）选择合适的灌洗部位：对于弥漫性的间质性肺疾病，宜选择右肺的中叶(四级或五级支气管)或左肺的舌段；对于局限性的肺病变，则应在相应的病变支气管肺段进行肺泡灌洗。（2）肺泡灌洗操作步骤：首先，在需要灌洗的肺段，经活检孔导入一硅胶管并注入2%利多卡因1～2 mL，做灌洗肺段局部麻醉；然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入37℃灭菌生理盐水。每次5～10 mL，总量15～25 mL，一般不超过30 mL；随即用50～100 mmHg(1 mmHg= 0.133 kPa)负压吸引回收灌洗液。（3）适合检测的肺泡灌洗液应符合以下要求：①达到规定的回收率，通常为40%～60%；②不混有血液，红细胞数小于10%；③不应混有多量的上皮细胞（一般小于3%)。将采集的灌洗液装入塑料离心管内，在4℃下以1200 r/min离心10 min，将滤液离心后分离取沉淀物供细胞检查。

1.2.2.2巨噬细胞标记及检测肺泡灌洗液以冷PBS洗涤2次，每次1000 r/min，4 min，4℃。（1）胞膜抗原染色：留取（流式管）细胞沉淀，向内依次加入2种抗体：CD86-FITC 20μL；CD204-APC 10μL；低速涡旋混匀，冰屑中避光孵育15 min。（2）清除未结合的荧光抗体：加入1%BSA-PBS（牛血清白蛋白）2 mL，离心1200 r/min，4℃，4 min，弃上清。（如标本有肉眼血色，溶血：每管加入10倍稀释后的溶血素2 mL，室温避光10 min）（3）破膜：加入破膜剂100μL，低速涡旋混匀，避光，冰屑孵育20 min；再用100μL 10倍稀释后的buffer wash试剂洗2遍，弃上清。（4）清除破膜剂：加入1%BSA-PBS（牛血清白蛋白）2 mL，离心1200 r/min，4℃，4 min，弃上清。（5）胞内抗原染色：样品管中加入胞内染色的抗体加入CD68-PE 20μL，低速涡旋混匀，冰屑中避光孵育15 min。（6）再清洗：加入1%BSA-PBS（牛血清白蛋白)2 mL，离心1200 r/min，4℃，4 min，弃上清。（7）固定：细胞沉淀加入200μL 1%多聚甲醛，避光，以备检测。（8）检测：使用CaliBRITE标准微球，调节流式细胞仪PMT电压，荧光补偿，灵敏度。在CellQuest软件下，获取10万个左右细胞，并用其测定标本中的AMs (CD68+)、M1(CD86+CD68+)、M2(CD204+CD68+)水平。

1.2.2.3尿乳果糖/甘露醇比值（尿L/M）的检测尿L/M值水平的检测应用1100型高效液相色谱仪(HPLC)，由美国Agilent公司生产。标准品为Sigma公司生产的色谱纯的乳果糖与甘露醇。检测的前一日晚22:00开始禁食，检测当日晨8:00仍空腹，并排空膀胱，予40 mL的检测液经胃管内注入，包含乳果糖10 g和甘露醇5 g，再用清水20 mL冲洗胃管，以减少胃管内的残留。给药30 min后，不限制饮水及营养制剂的静脉输注。灌药后，收集患者六小时内的全部尿液并记录尿量，取其中15 mL尿液置于的试管中，并送实验室，将其置于-70℃冰箱保存，以待检。从冰箱中取出样本，取尿液2 mL再加2 mL色谱纯的乙腈，漩涡震荡混匀后，放置于离心机（4℃、4000 r/min）离心10 min，将分离后的上清液取1 mL待检。采用HS色谱工作站，测得峰面积后。并根据乳果糖和甘露醇的标准品的峰面积图形，计算乳果糖和甘露醇的标准曲线公式。根据标准曲线公式和样本的峰面积，可以算出样本中乳果糖和甘露醇的含量，从而进一步计算出乳果糖和甘露醇的比值(L/M)。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0统计软件。试验中的计量资料采用均数±标准差(±s)表示，先进行数据的方差齐性的检验，对于方差齐者采用方差分析，方差不齐者用平方根进行数据变换，使之成为方差齐性后，再进行方差分析；排气排便时间比较采用两独立样本的t检验；其余指标的比较采用重复测量资料的方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肠屏障功能指标比较

2.1.1肠功能障碍恢复时间通过检测排气排便时间，发现中药组的排气排便时间明显短于对照组，两组患者的平均排气排便时间见表2。

2.1.2尿L/M值比较中药组和对照组中尿L/M值均随着时间的变化而下降。到第5 d，中药组和对照组间尿L/M值变化的差异有统计学意义（P＜0.05），中药组较对照组下降更明显，见表3。

表2　两组患者平均排气排便时间比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05

组别中药组对照组n 30 30肛门排气时间(h) 14.9±2.6a19.2±3.5肛门排便时间（h）20.7±2.3a26.0±4.1

表3　两组患者的尿L/M比较(±s)

组别中药组对照组tFP n 30 30第0 d 9.49±1.89 9.55±1.90 -0.108 0.914第1 d 9.41±1.86 9.42±1.91 0.003 0.956第3 d 7.21±1.69 8.38±188 0.735 0.395第5 d 3.97±1.53 7.01±2.44 4.962 0.03

2.2肺功能观测通过检测动脉血气分析，发现呼吸频率、PaCO2等在中药组和对照组间不具有统计学意义(P＞0.05)。治疗后两组OI（PaO2/FiO2）均有所升高，具有统计学意义（P＜0.05）。第1、3 d两组评分无统计学差异，第5 d时中药组患者OI较对照组明显升高，组间比较有显著统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4　两组患者OI数值比较(±s)

注：使用呼吸机者，不考虑呼吸末正压（PEEP）,与对照组同时间点组间比较,aP＜0.05。

组别中药组对照组n 30 30第1 d 189.09±16.10 183.34±17.03第3 d 215.24±25.09 204.20±19.31第5 d 255.44±18.18a222.76±15.15

2.3腹腔感染致ALI患者肺泡灌洗液中AMs、M1、M2的比例变化应用流式细胞仪测定两组肺泡灌洗液AMs(CD68+)、M1(CD86+CD68+)、M2(CD204+CD68+)的变化结果如图1。

根据两组患者肺泡灌洗液中AMs、M1、M2的比例变化发现，在中药组和对照组中AMs、M1随着时间的变化均下降，两组M2随着时间的变化均升高；且到第5天，中药组和对照组之间AMs、M1、M2的比例变化的差异有统计学意义（P＜0.05），中药组AMs、M1较对照组下降更明显，中药组M2较对照组升高更明显。分别见表5、表6、表7。

3　讨论

祖国医学认为，肺与大肠互为表里，大肠的通降影响着肺的肃降。大承气汤出自《伤寒论》，作为通里攻下法治疗阳明腑实证最经典的方剂，在对“肠病及肺”的腹腔感染合并ALI患者治疗中疗效得到了广泛的证实。

图1　采用流式细胞仪测定AMs(CD68+)、M1(CD86+CD68+)、M2(CD204+CD68+)结果举例

表5　两组患者肺泡灌洗液中AMs变化比较(±s)

组别中药组对照组tFP n 30 30第0 d 97.45±0.87 97.86±0.93 -1.745 0.086第1 d 97.31±0.77 97.79±0.90 3.912 0.053第3 d 96.79±0.81 97.02±1.02 3.441 0.069第5 d 92.65±1.06 94.82±0.90 23.424 0

表6 两组患者肺泡灌洗液中M1变化比较(±s)

组别中药组对照组tFP n 30 30第0 d 71.66±6.17 72.35±6.31 -0.424 0.673第1 d 71.39±6.33 71.74±6.03 0.106 0.106第3 d 62.69±7.50 65.20±6.28 0.547 0.462第5 d 42.17±6.99 55.49±6.26 6.905 0.011

表7　两组患者肺泡灌洗液中M2变化比较(±s)

组别中药组对照组tFP n 30 30第0 d 15.75±2.63 14.57±2.50 0.834 0.08第1 d 16.32±2.78 15.19±2.75 3.088 0.084第3 d 20.45±4.94 18.87±4.20 3.075 0.085第5 d 44.72±5.36 35.09±7.37 4.094 0.048

腹内感染常由空腔脏器（多源于消化道）感染扩展至腹膜腔内，多有腹膜炎表现，可合并脓肿形成。这种严重的应激会抑制肠道的蠕动、分泌、消化和免疫防御作用，作为细菌和内毒素的储存库，体内与外环境接触的主要屏障之一，肠道功能一旦抑制，大量肠内容滞留及内毒素池的扩大，肠屏障形态学完整性受到破坏、通透性增加，免疫防御功能受损，肠组织缺血/再灌注损伤。这些因素将随即使机体面临着免疫系统被持续过度激活的危险。激活炎症细胞，使包括细胞因子、自由基、补体系统和其他多种炎性介质的大量释放，形成所谓“级联效应”，导致强烈的全身性炎症反应，加重肠道损害，最终可导致MODS的发生[1-2]。而临床最常见的则是出现腹腔感染合并ALI。也有报道显示，肠道细菌移位，引发肠外器官组织损伤，最易致肺毛细血管壁和肺泡壁受损,内皮屏障功能发生障碍[3]，巨噬细胞活化并释放炎性细胞因子，最终导致急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。肠腔内压力增高，肠壁静脉淤积，动脉血流受阻，缺血再灌注损伤，都使全身炎症介质的爆炸性增加，同时也进一步加重了局部炎症反应及肠黏膜损伤，恶性循环地推动着病情的发展[4]。那么，如何才能同时解决恢复肠道屏障功能和控制肺损伤，成为了临床医师关注的问题。

乳果糖是一种经黏膜上皮细胞细胞旁途径吸收的结构稳定的化合物，而甘露醇经口服后，须经细胞内途径吸收进入血液。故发生腹腔感染时，通常会引起乳果糖与甘露醇(L/M)在尿中的比值变大，尿L/ M值也提示肠黏膜通透性的改变[5]。在本研究中，中药组的尿L/M值较对照组下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。故表明，在肠黏膜屏障功能的改善方面中药组明显优于对照组。并且，中药组的排气排便时间较对照组明显提前，这也提示，大承气冲剂对腹腔感染患者肠道功能的恢复、改善肠黏膜的屏障功能，降低内毒素血症，从而减轻级联放大的炎症反应的激活效果显著。

通过有关项目回顾性分析发现:氧合指数较呼吸频率、肺泡动脉氧分压差、PaO2、等肺脏功能指标，更适合作为ALI/ARDS的诊断和病情评定指标[6-7]。故本研究亦选用OI（通过临床检测动脉血气分析，计算出PaO2/FiO2）来评定ALI/ARDS的病情严重程度。

腹腔感染导致脓毒症时，血浆灭活内毒素能力下降，血清内毒素水平升高，刺激单核细胞向组织游走，进入肺组织并聚集、分化成为具有高度可塑性的肺泡巨噬细胞[8-9]。在抗原提呈或释放多种细胞因子、共刺激分子活化作用下发育出现两类不同亚型：促炎反应的M1和抗炎反应的M2。其中，M2可促进TH2型免疫应答并抑制M1活性，抑制M1抗原提呈和促炎因子的分泌，并通过血管生成因子和成纤维因子促进组织愈合[10-11]。若M1激活反应过强，将产生大量炎症因子，则会使组织受到严重损害；若M2激活反应过强，将导致组织纤维化，进而形成慢性炎症[12-13]。两种不同状态的巨噬细胞激活达到平衡，肺损伤才能得以控制，进而减轻；反之则恶化。而就严重腹内感染引发的急性肺损伤早期而言，分别抑制和促进M1和M2的极化可能将更意义[14]。

本研究表明，在严重腹腔感染合并ALI患者中，以肺泡灌洗液中AMs水平及M1、M2的比例为指标在服用大承气冲剂的中药组与服安慰剂的对照组之间存在显著差异：在中药组中AMs水平及M1比例随着时间变化较对照组下降得更明显，M2比例随着时间变化中药组较对照组升高。此外，在两组患者随治疗进展肠功能障碍与ALI严重程度不断减轻的同时，中药组其肠功能、肺功能改善的程度较对照组更高，且有明显的差异。各组内AMs及M1随肠功能、肺功能改善而见回落趋势，治疗后两组患者OI、M2均有所升高；充分提示了AMs水平及M1、M2的比例在严重腹腔感染合并ALI患者病理生理过程中的重要作用，可以在一定程度上反映了其肺损伤程度。中药组大承气冲剂能有效抑制肺巨噬细胞活化，降低M1比例，促进M2生成，进而减轻炎症反应，保护肠黏膜屏障功能及肺组织。其可能的作用机制[15]是：(1)通里攻下法（大承气冲剂）清热解毒，减少内毒素的产生；大承气冲剂通里攻下，减轻肠黏膜屏障功能障碍，减少肠道细菌移位和内毒素吸收入血；(2)大承气冲剂改善肠黏膜屏障功能，其中君药大黄更是有活血通络之功，可改善肠管、肺组织等脏器血流，从而带来全身免疫机能的恢复，降低肺毛细血管通透性、抑制AMs聚集活化，减少M1比例，促进M2生成，减轻炎症反应和肺组织损伤。

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（收稿：2015-09-24修回：2015-11-06）

（责任编辑傅强）

The Effect of Dachengqi Granule on Alveolar Macrophages in Patients Suffering from Intra-abdominal Infection with Acute Lung Injury

SONG Yuan,XIE Ji-liang,ZHANG Nan,et al.Tianjin Nankai Hospital, Tianjin(300100),China

ObjectiveTo study the effect of Dachengqi granule on alveolar macrophages of patients suffer⁃ing from intra-abdominal infection(IAI)combined with acute lung injury（ALI）.MethodsWith observation of severe IAI complicating ALI in adult patients，60 caseswere randomly divided into two groups—chinese medicine group(30 cases)and control group(30 cases),the symptoms and signs were observed.The control group was given conventional western medicine treatment and a placebo,chinese medicine group was given con⁃ventional western medicine treatment and combined with Dachengqi granule.The treatmenta were implemented for five days.In 1,3,5 days,we recorded the time of exhaustion and defecation,the ratio of lactuloseto mannitol in urine(L/M ratio)and oxygenation index value(OI).We collect bronchoalveolar lavage fluid lines each index de⁃tection.Quantitative detection by flow cytometry instrument was used to detect the levels of bronchoalveolar la⁃vage fluid in alveolar macrophages and percentage of subtype M1 and M2.ResultsWith the extension of time,two groups of urine L/M ratio were both going down，and at the 5th day,they were 3.97±1.53，7.01±2.44，compared with the control group patients，chinese medicine group was more obviously(P＜0.05)；OI of two groups at the 5th day are 255.44±18.18，222.76±15.15，chinese medicine group obviously increased(P＜0.05). In the advance,in the treatment of two groups of patients with bowel dysfunction caused by IAI and ALI,the se⁃ verity was continuously reduced.At the same time, the chinese medicine treatment improved the degree of the bowel function and lung function is better thanthat of control treatment,and there is obvious difference（P＜0.05）.Comparing two groups of patients data after five days treatment,AMs percentage are(92.65±1.06)%and 94.82±0.90%,proportion of M1 are(42.17±6.99)% and(55.49±6.26)%,chinese medicine group obviously decline(P＜0.05)；besides,proportion of M2 are(44.72± 5.36)%and(35.09±7.37)%,chinese medicine group is higher than the control group（P＜0.05）.From another perspective,downtrend of AMs,M1 and uptrend of M2 in both of the two groups,with the function of bowel and lung beter,adequately point out that downtrend of AMs,M1 and uptrend of M2 are importent roles in the physio⁃logical pathology process of serious IAI and ALI patients.ConclusionIn the early days of IAI combined ALI,application of Dachengqi granule can effectively reduce pulmonary macrophage activation and aggregation, reduce the proportion of M1,rise the proportion of M2,thereby,reduce the release of inflammatory cytokines,re⁃duce lung injury.

Dachengqi;intra-abdominal infection;acute lung injury;alveolar macrophages

R655.3

1007-6948(2015)06-0547-06

10.3969/j.issn.1007-6948.2015.06.001

天津市卫生局科技基金资助项目（11KG129）

天津市南开医院（天津 300100）

解基良，E-mail：zhangnan1975man@sina.com.cn