成年大鼠脑透析液和血清中褪黑素含量的测定

孟 涛，郑志竑，叶 婧，林 玲

2.中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所 化学污染与健康安全重点实验室，北京 100050

褪黑素（melatonin，MLT）主要是由松果体分泌的一种吲哚类激素，具有明显的昼夜节律性，分泌高峰在夜间，白天分泌减少，且合成与分泌受光／暗周期信号、神经系统等因素的调节[1－2]。松果体分泌MLT后立即释放入脑脊液和血液，并与广泛分布在中枢神经系统与外周组织器官靶细胞膜上的MLT受体相结合，参与机体的生长、发育、成熟和衰老等生命过程。既往的研究主要针对MLT功能以及血清和松果体MLT含量变化；近年来，研究者开始关注脑脊液中MLT的动态变化、脑内MLT与血清MLT的相关性。本研究以正常成年大鼠为研究对象，将引导管置入前脑纹状体内，采用脑微透析技术动态收集透析液样本，并采集大鼠尾静脉血；用高效液相色谱（high－performance liquid chromatography，HPLC）－荧光法测定大鼠体内的MLT，并分析脑透析液与血清中MLT之间的相关性；同时用酶联免疫法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清中MLT含量，比较2种检测方法的一致性，为进一步了解体内MLT的分泌模式、MLT含量的测定提供一种更为合理、有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8只健康雄性SD大鼠，体质量为（200±20）g[上海斯莱克实验动物公司，许可证号：SCXK（沪 ）2007－0005]。 大 鼠 在 （23±2）℃、30%～45%湿度下置于无菌层流架内饲养，光暗周期12h／12h，自由饮食饮水。

1.1.2 试剂 ELISA试剂盒（美国Uscnk公司）；MLT标准品（美国Sigma公司）；甲醇和三氯甲烷（德国Merck公司）；实验用水为Millipore超纯水；其他均为国产试剂。

1.1.3 仪器 大鼠脑立体定位仪（SR－5M，日本Narishige公司）；微透析探针及脑微透析系统（CMA12，瑞士CMA 公司），探针外径0.5mm、膜长4mm；反相色谱柱（Smart RPC18，美国Grace公司）；HPLC（Waters 600）及荧光检测系统（Waters 2475）（美国 Waters公司）；酶标仪（FLx800，美国BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 HPLC－荧 光 法 MLT 流 动 相 成 分 为Na2HPO435.8g／L，EDTA·2Na 0.372g／L 和30%甲醇，pH 6.4，检测系统为Waters 2475荧光检测器和Smart RPC18反相色谱柱（150mm×4.6mm，粒径5μm），利用单泵恒流洗脱，柱温为30℃，流速为0.9mL／min。荧 光 检 测 器 设 定 激 发 波 长 为285nm，发射波长为345nm。

1.2.2 ELISA和 HPLC－荧光法的性能验证 性能验证所用的MLT标准品源自美国Sigma公司。ELISA法：（1）检出限：在一块酶标板中同时做5孔阴性对照孔，以OD值大于阴性对照平均值的2倍标准差视为阳性，此时OD值对应的MLT检测浓度为检出限。（2）线性范围：检测信号与标准样浓度呈线性关系的范围，把相当于10倍阴性对照孔的标准差相应的浓度规定为线性范围的下限；当标准样浓度大于某一数值后，直线开始弯曲，检测信号不再随标准样浓度的增加而线性增加，将此点对应的浓度确定为上限。（3）精密度：在相同条件下，多次平行分析结果相互接近的程度，用偏差来表示；日内精密度是指同一浓度标准样在同一天内检测5次所得值的偏差；日间精密度是同一浓度的标准样在不同天内检测5次所得值的偏差。HPLC－荧光法：（1）将待测 MLT标准样稀释一系列浓度，进样分析，当观察哪个浓度的标准样对应信噪比（仪器直接读出）为3时，此浓度即为检出限。（2）线性范围下限规定为噪声（仪器直接读出）的2倍所对应的浓度，上限规定同ELISA 法。（3）精密度规定同ELISA法。

1.2.3 脑微透析术及透析液样本的收集 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg／kg），固定于脑立体定位仪上。根据大鼠脑立体定位图谱，将微透析引导管置入 右侧纹状体（AP：＋1.0mm，MR：＋2.5mm，DV：－4.0mm），并用小螺丝和牙科水泥固定，静养1周后进行脑微透析术。在收集脑透析液过程中每只大鼠均单独进行，将大鼠放入清醒动物的自由活动装置中，拔出引导针，插入微透析探针，用 Ringers液（140mmol／L NaCl，4mmol／L KCl，1.2mmol／L CaCl2，1mmol／L MgCl2，pH＝7.4）平衡灌流 1h 后，以 2μL／min 收集10：00，14：00，18：00，22：00，2：00 和6：00各 时 间 点下大鼠安静、清醒状态下的透析液样本，每个时间点收集3管，每管收集10min，样本收集好后行色谱荧光法测定MLT含量，并取3管的平均值作为该时间点的MLT水平。在晚上收集样本时注意避免白光，以免干扰MLT的昼夜节律。探针每次使用前先做探针体外回收率的测定，用以折算透析液样本中MLT的浓度，并在透析后再次测定探针回收率，分析探针透析效能的变化。

1.2.4 血样的采集及处理 于脑透析术后次日22：00，采集大鼠尾静脉血液标本1mL，4℃静置过夜，1 000g离心20min，取上清。取50μL血清直接用ELISA法测定MLT含量，余下血清用三氯甲烷反复萃取，将三氯甲烷层真空干燥、氮气吹干、最后残留物用流动相溶解进样，行色谱荧光法检测MLT含量，并计算血清中MLT的提取回收率。

2 结 果

2.1 MLT检测方法的建立 与ELISA法相比，HPLC－荧光法具有较低的检出限值、呈较好的线性关系，日内、日间精密度＜6%，重现性较好，具有灵敏、快速、准确的特点（表1）。

表1 2种褪黑素检测方法的比较Tab 1 Comparison of two methods for detection of MLT levels

2.2 大鼠脑透析液及血清中的MLT含量测定

（1）用色谱法测定探针透析前、后对MLT的回收率分别为（13.10±1.13）%和（12.33±1.02）%，两者差别无统计学意义（n＝6，P＝0.508），提示探针对MLT透析效能比较稳定。（2）用荧光检测器测定22：00脑透析液及血清样本中MLT，色谱检测结果见图1，MLT的分离效果良好，出峰时间在10min左右，22：00血清中的MLT峰面积明显高于脑透析液（n＝8，P＜0.001）。（3）HPLC－荧光法测定2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00各时间点大鼠纹状体脑透析液中的 MLT含量分别为（32.99±2.22），（18.25±2.27），（4.03±1.70），（2.92±1.08），（12.08±1.77）和（21.83±2.04）pg／mL，具有明显的昼夜节律（图2）。（4）HPLC－荧光法测定22：00血清中的 MLT含量为（82.62±8.09）pg／mL，提取回收率＞90%，血清与透析液中的MLT含量具有高度正相关（r＝0.987，P＜0.001）（图3）；ELISA测定血清中的 MLT含量为（81.31±9.62）pg／mL，用2种方法测定血清中的MLT含量差别无统计学意义（P＝0.115）。

图1 HPLC检测正常大鼠纹状体透析液和血清中22：00的褪黑素水平Fig 1 HPLC traces of MLT at 22：00in striatal dialysate and serum in normal rat

图2 纹状体透析液褪黑素水平在2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00的波动情况Fig 2 Fluctuations in MLT levels in striatal dialysate at 2：00，6：00，10：00，14：00，18：00and 22：00

图3 脑透析液和血清中褪黑素水平的相关性Fig 3 Correlation between brain dialysate MLT and serum MLT

MLT主要由松果体以色氨酸为原料，经过羟化、脱羧及N－乙酰转移及甲基化等催化反应合成的内源性吲哚类激素，在体内MLT水平相对较低，波动范围较大，易受多种内源性物质的影响，一般较难测定。随着对MLT的深入研究，有关MLT的检测方法也得到相应发展[3]。目前主要的测定方法有放射免疫分析法、ELISA法、HPLC－荧光法、HPLC－电化学法、HPLC－质谱联用法、气相色谱（GC）－质谱联用法等。放射免疫分析法简单、灵敏，但需放射性试剂，且与其结构相似的内源性物质易发生交叉反应，重现性较差；HPLC－质谱联用法和GC－质谱联用法灵敏度和选择性均很高，但操作复杂，成本高，且GC－质谱联用法需将样本进行柱前衍生后变成挥发性的物质再检测，不利于一般实验室的开展；ELISA法灵敏度低、耗时长、重现性尚可，且样本前处理简单；HPLC－荧光法简单、快速、灵敏、重现性好、成本低，适合一般实验室的推广。本研究在参考国内外文献的基础上，结合本实验室设备的特点，对检测条件进行适当改进，与已报道的方法相比[4－6]，本研究所用的HPLC－荧光检测法，柱温低（30℃）、出峰时间短（10min左右）、灵敏度高（检出限为0.1pg／mL）、分离效果好（分离度＞1.2），且不经衍生即可测定，是一种简单、快速、灵敏、准确、成本低、重现性好的测定MLT含量的方法。

3 讨 论

MLT由松果体合成、分泌后一部分释放入脑脊液，与中枢神经系统靶细胞膜上的受体结合，从而发挥中枢生物学效应，且随着年龄的增长，松果体合成MLT含量逐渐下降。近来的研究表明，MLT不仅是重要的睡眠诱导调节物质，其体液生理浓度的变化可能与某些疾病有关，许多疾病（如失眠症、抑郁症、癌症、帕金森病等[7－11]）的患者及动物模型MLT水平、分泌模式均发生了变化。为了更好地观察MLT分泌模式，本研究采用脑微透析术动态收集成年大鼠纹状体透析液，观察昼夜各时间点MLT水平的变化。脑微透析术作为检测细胞外神经递质浓度的方法，近年来发展迅速，但同时也存在一些问题。例如，由于探针回收率变化等原因，实际透析液中待测物质的浓度仅代表其在脑内细胞外间隙浓度的部分水平，为此本研究在实验前对所用探针进行体外相对回收率的测定，以确保后续实验数据的可比性。本研究使用的探针在体外对MLT的相对回收率为12%～13%，且透析前后探针回收率无显著差异（n＝6，P＝0.508），提示在透析过程中探针的透析性能比较稳定，可较为准确地反应脑内的MLT水平。通常，在暗光条件下，哺乳动物开始分泌内源性 MLT[12]。本研究选择了6个时间点（2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00），从图2可以看出，脑透析液中MLT含量具有明显的昼夜节律，其分泌与光照有密切关系。白天含量非常低，一般＜5pg／mL，夜晚急剧升高，并于凌晨2点出现峰值（32.99±2.22）pg／mL，峰值出现时间与文献报道基本一致[13]，且 MLT在体内半衰期较短[14]，均提示 MLT发挥效应的时间主要在晚上。上午10点 以 后 降 至 5pg／mL 以 下，谷 值（2.92±1.08）pg／mL出现在14：00左右，18：00以后MLT分泌水平又开始增加，晚上22：00增至（21.83±2.04）pg／mL。此外，本研究发现，8只正常成年SD大鼠MLT分泌起点及分泌模式基本一致，为进一步研究药物和光照等外界因素对机体生物钟的影响提供了可能。

MLT由松果体分泌后一部分释放入血液，通过外周组织器官靶细胞膜上的受体结合，从而发挥外周生物学效应。本研究采用 HPLC－荧光法和ELISA法检测22：00大鼠血清中的MLT含量分别为（82.62±8.09）和（81.31±9.62）pg／mL，提示2种检测方法差别无统计学意义，具有较好的一致性。但用色谱荧光法检测血清中的MLT时，所需样本量比较大，样本前处理复杂，需经三氯甲烷反复萃取，提取回收率为90%左右；而ELISA法所需样本量小，不需对血清进行处理，可直接进行检测。此外，本研究分析脑透析液和血液中MLT含量的变化，经Pearson相关分析两者呈高度正相关（r＝0.987，P＜0.001），血清 MLT含量的变化可间接反映脑内MLT的变化趋势。本研究还发现，22：00血清 MLT含量明显高于脑透析液（n＝8，P＜0.001），推测松果体分泌MLT可能主要释放入血液。

本研究结果表明，用改良的HPLC－荧光检测法测定大鼠脑透析液以及血清中的MLT含量简单、快速、灵敏、准确、重复性好、成本低，血清中 MLT和脑内MLT具有很好的相关性，且HPLC－荧光法和ELISA法测定血清MLT具有较好的一致性，为探究体内MLT分泌模式、测定MLT含量提供一种有效的方法。

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