华法林个体化剂量与CYP2C9／VKORC1基因组之间的关系

林善明，李增棋，王 航，陈 昆，余 毅，王长连

华法林是一类含有4－羟基香豆素基本结构的抗凝血药，通过抑制维生素K依赖的相关凝血因子的合成而发挥作用，临床上主要用于血栓栓塞的预防。但华法林治疗安全范围窄，个体用药剂量差别大，用药剂量很难掌握[1]。目前，临床上主要通过定期监测凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、国际标准化比值（international normalized ratio，INR）来调整华法林的用药剂量。心外科换瓣手术后患者以INR波动于1.8～2.5时抗凝效果最佳，出血、栓塞等风险较低。近年来研究表明，华法林代谢相关的基因多态性如细胞色素氧化酶P450 2C9＊1／＊3（cytochrome P450 2C9＊1／＊3，CYP2C9＊1／＊3）、维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1－1639A／G（VKORC1－1639A／G）与个体间华法林维持剂量差异具有重要关系[2－5]。

本研究拟通过PCR－杂交技术对患者进行CYP2C9＊1／＊3、VKORC1－1639A／G 基因分型，评估年龄、性别、体质量指数（bady mass index，BMI）、VKORC1－1639A／G和CYP2C9＊1／＊3基因型等变量与华法林抗凝剂量之间的关系，建立一个适合福建人群的基因组学的华法林给药模型预测剂量公式，指导华法林个体化用药。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2013年11月—2015年2月就诊笔者医院的患者119例，男性50例，女性69例，年龄（54.7±17.7）岁（12～80岁）。纳入标准：规律服用相同剂量华法林钠片（商品名：玛尔维，芬兰奥立安公司）3月，并且连续监测3次INR均波动于1.8～2.5的福建籍汉族患者，其中心脏瓣膜置换术后患者86例，心房颤动患者24例，血栓栓塞患者9例（表1）。

排除标准：严重肝功能不全[丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）＞8～10ULN或者ALT＞3ULN且血清总胆红素＞2ULN]；严重肾功能不全（当内生肌酐清除率下降到20mL／min以下，血尿素氮水平17.9～21.4mmol／L，血肌酐≥442μmol／L）；甲状腺功能异常；肿瘤患者；结缔组织疾病；心力衰竭患者（慢性心功能不全：心功能Ⅳ级）；妊娠；同时服用与华法林药效动力学及药物动力学相互作用的药物（详见药品说明书）。

1.2 试剂 血液基因组DNA提取试剂盒（DP333，北京天根生化公司）；PCR产物测序（上海生工生物工程有限公司）；PCR引物合成（上海百傲科技有限公司）；CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒（PCR－芯片杂交法）（注册号：3401328，上海百傲科技有限公司）。

1.3 仪器 全自动血凝分析仪（STA－R Evolution，北京思塔高诊断产品贸易有限责任公司）；双光束紫外可见分光光度计（TU1901，北京普析通用仪器有限责任公司）；基因芯片图像分析软件（V2.0，上海百傲科技有限公司）；生物芯片识读仪（BE2.0，上海百傲科技有限公司）；e－Hyb全自动杂交仪（BR－526－24型，上海百傲科技有限公司）；PCR仪（Thermal cycler T100，美国Bio－Rad公司）；高速离心机（Pico21，美国Thermo公司）；电热恒温振荡水槽（DKZ－2型，上海精宏实验设备有限公司）。

1.4 方法 采集静脉血用于检测INR、VKORC1及CYP2C9基因型。记录患者信息：年龄、性别、身高、体质量、肝肾功能及华法林稳态剂量。

1.4.1 INR值测定 采集空腹枸橼酸钠抗凝静脉血2mL，用全自动血凝分析仪检测PT（黏度法又称磁珠法），自动计算得出INR值。

1.4.2 基因型测定

1.4.2.1 采样及DNA扩增 入选患者采集全血于EDTA抗凝管中，24h内用吸附柱法提取DNA，以紫外法检测DNA纯度及浓度。精密吸取符合条件的DNA模板10μL，加入扩增液与反应液，在25μL体系中扩增：50℃预变性5min→94℃变性30s→72℃退火延伸30s→35次循环→72℃延伸5min。PCR反应后产物于2～8℃保存。

1.4.2.2 杂交反应和基因分型 以上PCR产物加入杂交缓冲液，与抗体和显色剂交于基因芯片上进行图像扫描与数据分析，输出检测结果。根据检测结果，CYP2C9可分为下列6种基因型：＊1／＊1（＊2CC／＊3AA）、＊1／＊2（＊2CT／＊3AA）、＊1／＊3（＊2CC／＊3AC）、＊2／＊2（＊2TT／＊3AA）、＊2／＊3（＊2CT／＊3AC）、＊3／＊3（＊2CC／＊3CC）；VKORC1可分为下列3种基因型 VKORC1－1639GG、VKORC1－1639GA、VKORC1－1639AA。

1.5 统计学处理 数据采用SPSS 18.0统计软件处理，结果以±s表示，不同性别、不同基因型之间华法林剂量比较用两样本t检验，P＜0.05为差别具有统计学意义。用Pearson相关系数来分析华法林剂量与年龄、BMI的相关关系。多元线性回归用于分析华法林剂量与各变量之间的关系构建华法林剂量给药模型，P＜0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 性别与华法林剂量的关系 采用两样本t检验分析，男性华法林用量为（3.00±1.06）mg／d，女性为（2.80±0.96）mg／d，性别对华法林稳态剂量影响差别无统计学意义（t＝0.735，P＞0.05）。

2.2 年龄和BMI与华法林的剂量关系 采用Pearson线性相关初步分析，华法林剂量与年龄负相关（r＝－0.276，P＝0.030），而与 BMI正相关（r＝0.142，P＝0.029）。

2.3 CYP2C9和VKORC1基因多态性与华法林的剂量关系 在VKORC1基因型检测结果中，GG基因型出现2例，华法林用量均为7.5mg／d，统计学上不能代表一个分组，所以剔除该值。由于在中国汉族人群的不存在CYP2C9＊2型突变，CYP2C9＊3型突变较少（1%～3%）[6－7]，笔者在基因检测过程中也未检测到＊3＊3基因型。因此，所建立的模型中CYP2C9基因只包含了＊1＊3和＊1＊1基因型，VORC1基因只包含了AA和GA基因型。采用两样本t检验初步分析，尚不能认为CYP2C9和VKORC1不同基因型与华法林剂量之间差别存在统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 不同基因型间华法林剂量差异比较Tab 1 Differences in warfarin dose for each genotype

2.4 建立多元线性回归分析模型 经年龄、性别、BMI调整后的多变量模型，采用多元线性回归分析，模型中包含年龄、BMI、CYP2C9和VKORC1基因型，多元线性回归方程的建立采用逐步纳入法，并进行验证，可以将CYP2C9（P＝0.039）和 VKORC1（P＝0.023）基因型纳入方程，纳入后模型更稳定，预测力更强，排除了性别（P＝0.254）与疾病种类（P＝0.465）因素，该模型能够最好的估计华法林剂量（r2＝0.212，P＝0.013，表2），得出最终回归方程为：

在方程中，年龄为岁数，BMI＝体质量／身高＾2（体质量为kg，身高为 m），CYP2C9基因型是＊1＊1为1，基因型是＊1＊3为0，VKORC1基因型是AA为1，基因型是GA为0。

表2 多元线性回归方程的系数Tab 2 The coefficients of multivariante equation of linear regression

3 讨 论

华法林抗凝治疗（特别是在抗凝治疗初期）经常出现用药过量导致出血的风险，并且很难预测给药剂量。这项研究旨在结合患者年龄、BMI、CYP2C9和VKORC1基因型因素预测华法林稳态时给药剂量，用以有效指导临床用药。

笔者采用两样本t检验，提示暂不能认为CYP2C9和VKORC1不同基因型与华法林剂量之间存在显著差异，但采用逐步纳入法建立的多元线性回归模型，并对其进行验证得知纳入基因型后模型更稳定，预测力更强。在男性和女性患者中华法林稳态剂量无统计学意义，性别对多元线性回归的统计学模型依旧没有做出显著贡献。因此，所建立的多元线性回归模型中包含了年龄、BMI、CYP2C9（＊1／＊3和＊1／＊1）和 VKORC1（AA和 GA）基因多态性，排除了性别因素，该模型能有效解释了约21.2%的华法林个体间稳态剂量差异。

对映体S－华法林约比R－华法林抗凝有效5倍，原因主要是在肝脏经CYP2C9代谢。野生型CYP2C9＊1两个主要突变CYP2C9＊2和CYP2C9＊3，导致酶活性降低，华法林代谢减慢，最终个体抗凝所需的华法林剂量偏低[8]，从建立的多元线性回归方程可知，CYP2C9＊1＊3基因型的稳态剂量会相对低于＊1＊1基因型。

华法林通过抑制VKOR，从而阻止维生素K的反复利用，致使维生素K依赖的凝血因子停留于无凝血活性的前体阶段而发挥抗凝作用。VKORC1是编码VKOR的一个重要亚单位基因，其启动子区的1639G＞A基因多态性可导致华法林个体剂量差异[9]。由于VKORC1GA基因型的启动子活性高于AA型，最终导致VKORC活性增高，表现为华法林抵抗，因此需要更大剂量的华法林来达到目标INR，所以VKORC1－1639GA比AA基因型所需华法林剂量高，这与笔者建立的模型是一致的。

本研究发现，大约有78.8%的个体剂量差异不能通过此模型解释。其他的伴随疾病、药物影响、饮食结构、日常生活习惯（如吸烟、饮酒等）及超过30种与华法林代谢相关的基因等可能导致这种个体差异[10]。如编码维生素K氧化酶CYP4F2的基因、编码微粒体中维生素K环氧化物还原酶EPHX1的基因突变等，均能导致华法林用药的个体差异[11－12]，需要更进一步的研究。

由于心脏瓣膜术后患者较房颤、血栓栓塞等患者对华法林更为敏感[13]，不能单纯依靠所建立的模型和相关算法来指导华法林用药，因此术后仍需反复监测PT及INR来帮助临床医生调整相应华法林用量。

[1]Anderson J L，Horne B D，Stevens S M.Randomized trial of genotype－guided versus standard warfarin dosing in patients initiating oral anticoagulation[J].Circulation，2007，116（22）：2563－2570.

[2]Klein T E，Altman R B，Gage B F，etal.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data[J].N EnglJMed，2009，360（8）：753－764.

[3]Ohno M，Yamamoto A，Ono A，etal.Influence of clinical and genetic factors on warfarin dose requirements among Japanese patients[J].EurJClinPharmacol，2009，65（11）：1097－1103.

[4]Wen M S，Lee M T M，Chen J J，etal.Prospective study of warfarin dosage requirements based on CYP2C9and VKORC1 genotypes[J].ClinpharmacolTher，2008，84（1）：83－89.

[5]Miao L Y，Yang J，Huang C R，etal.Contribution of age，body weight，and CYP2C9and VKORC1genotype to the anticoagulant response to warfarin：proposal for a new dosing regimen in Chinese patients[J].EurJClinPharmacol，2007，63（12）：1135－1141.

[6]Yuan H Y，Chen J J，Lee M T，etal.A novel functional VKORC1promoter polymorphism is associated with inter－individual and inter－ethnic differences in warfarin sensitivity[J].HumMolGenet，2005，14（13）：1745－1751.

[7]Huang S W，Chen H S，Wang X Q，etal.Validation of VKORC1and CYP2C9genotypes on interindividual warfarin maintenance dose：aprospective study in Chinese patients[J].PharmacogenetGenomics，2009，19（3）：226－234.

[8]Wadelius M，Chen L Y，Eriksson N，etal.Association of warfarin dose with genes involved in its action andmetabolism[J].HumGenet，2007，121（1）：23－34.

[9]Taube J，Halsall D，Baglin T.Influence of cytochrome P－450 CYP2C9polymorphisms on warfarin sensitivity and risk of over－anticoagulation in patients on long－term treatment[J].Blood，2000，96（5）：1816－1819.

[10]Wadelius M，Chen L Y，Downes K，etal.Common VKORC1 and GGCX polymorphisms associated with warfarin dose[J].Pharmacogenomics，2005，5（4）：262－270.

[11]McDonald M G，Rieder M J，Nakano M，etal.CYP4F2is a vitamin K1oxidase：an explanation for altered warfarin dose in carriers of the V433mvariant[J].MolPhar－macol，2009，75（6）：1337－1346.

[12]Issac M S，El－Nahid M S，Wissa M Y，etal.Is there a role for MDR1，EPHX1and protein Z gene variants in modulation of warfarin dosage？A study on a cohort of the egyptian population[J].MolDiagnTher，2014，18（1）：73－83.

[13]Rahman M，BinEsmael T M，Payne N，etal.Increased sensitivity to warfarin after heart valve replacement[J].Ann Pharmacother，2006，40（3）：397－401.