Livin和p－p38MAPK在乳腺癌中的表达及意义

韩艳春 于 宁 张 骞 刘鲁英

（1滨州医学院病理学教研室，烟台264003；2滨州医学院附属医院病理科，滨州256603）

乳腺癌的发生、发展及侵袭、转移是多种因素协同作用的结果，明确其分子机制有助于临床治疗。凋亡抑制因子Livin和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p－p38MAPK）在多种恶性肿瘤组织中存在不同程度的异常表达，而目前尚未见两者在乳腺癌中相互关系的研究报道。因此，我们采用免疫组织化学SP法和免疫印迹（Western blot）技术检测Livin和p－p38MAPK在乳腺癌及癌旁组织中的表达，并探讨两者表达的关系及临床意义。

材料和方法

1.临床资料

随机选取2007年12月至2010年1月间滨医附院病理科存档的乳腺癌组织蜡块标本70例，并经病理证实均为浸润性导管癌非特殊型，并选取其中30例对应的癌旁组织作为对照组。所有乳腺癌患者均为女性，年龄28～75岁（中位年龄51岁）。70例乳腺浸润性导管癌患者具体临床病理相关指标为：≤51岁者36例，＞51岁者34例；肿瘤最大径≤3cm者34例，＞3cm者36例；按2009年美国癌症联合会（AJCC）第七版乳腺癌分期［1］：I期23例，Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期20例；按Scarff－Bloom－Richardson病理分级［2］：I级20例，Ⅱ级38例，Ⅲ级12例；无腋窝淋巴结转移者34例；有腋窝淋巴结转移者36例。所有乳腺癌患者手术前均未行放化疗或内分泌等辅助治疗。用于Western blot检测的标本取自甲乳外科2009年1月至11月间行乳腺癌改良根治术的20例乳腺浸润性导管癌患者，每例选择离癌组织边缘5cm以上其相对应的癌旁乳腺组织为对照。新鲜乳腺组织标本离体后，立即切取组织块存入－80℃冰箱中冷藏待用。

2.方法

2.1 免疫组织化学

采用免疫组化SP法检测Livin、p－p38MAPK蛋白的表达及细胞内定位。具体操作严格按SP试剂盒说明书进行。Livin多克隆抗体购自武汉Boster公司，抗体工作浓度为1：50，p－p38MAPK单克隆抗体购自北京中杉金桥公司，抗体工作浓度为1：100。每批染色以 Livin、p－p38MAPK 已知阳性的乳腺癌切片为阳性对照，阴性对照采用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。结果判定：阳性物质表现为黄色或棕黄色颗粒。采用阳性细胞比例和染色强度相结合来综合判定表达情况，具体为：随机选择5个高倍镜视野，每个视野统计100个细胞，其表达阳性物质的细胞比例计分为：无阳性细胞为0分，1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；而染色强度计分为：无染色者为0分，淡黄色者为1分，棕黄色者为2分，棕褐色者为3分。最后以阳性细胞比例＋染色强度总分来判定最终表达情况，≥2分定为阳性表达。

2.2 Western blot检测

切取－80℃冰箱中保存的组织50mg左右，剪切成碎块，加入RIPA裂解液，冰上超声匀浆充分裂解组织，离心取上清，用Bradforde比色法蛋白定量后，经SDS－PAGE凝胶电泳、转膜、5%牛血清白蛋白封闭，加入相应一抗（抗 Livin 1∶500，抗pp38MAPK 1∶1000）置于4℃冰箱中孵育过夜，相应二抗室温条件下孵育2h，ECL发光显影。以β－actin作为内对照，应用Image J软件分析蛋白条带灰度值。实验至少重复3次。

3.统计学处理

应 用 SPSS 13.0 统 计 学 软 件，Livin、pp38MAPK表达与乳腺癌患者临床病理相关指标之间的关系分析采用χ2检验，Livin和p－p38MAPK的相关分析采用Spearman等级相关检验。检验水准为α＝0.05（双侧）。

结 果

1.Livin、p－p38MAPK蛋白在乳腺组织中的表达及细胞内定位

免疫组织化学检测结果显示，Livin蛋白阳性表达主要位于癌细胞的胞质，在64.3%（45／70）的乳腺癌中呈阳性表达（图1），对照组的30例癌旁乳腺组织中有4例呈阳性表达，其阳性率为13.3%；pp38MAPK蛋白阳性表达主要位于癌细胞的胞核，部分位于胞浆，在57.1%（40／70）的乳腺癌中呈阳性表达（图2），而对照组的癌旁乳腺组织未见明显阳性表达细胞。因此，乳腺癌组织的 Livin、pp38MAPK表达均显著高于癌旁组织（P＜0.05）。

2.Livin、p－p38MAPK蛋白表达与乳腺癌患者临床相关指标的关系

Livin、p－p38MAPK蛋白的表达与乳腺癌患者的不同TNM分期及有或无淋巴结转移密切相关，即在不同TNM分期的患者中，Livin、p－p38MAPK蛋白的表达随TNM分期的增加而随之升高（P＝0.000；P＝0.011）；在伴有腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者的Livin、p－p38MAPK蛋白表达水平显著高于无淋巴结转移的患者（P＝0.001；P＝0.009）。而Livin、p－p38MAPK蛋白表达均与乳腺癌患者的年龄、肿瘤的大小、组织学分级等其他临床病理指标无关（P＞0.05）（表1）。

图1 Livin在乳腺癌组织中阳性表达（SP×100）图2 p－p38MAPK在乳腺癌组织中阳性表达（SP×200）Fig.1The positive expression of Livin protein in breast cancer tissue（SP×100）Fig 2The positive expression of p－p38MAPK protein in breast cancer tissue（SP×200）

表1 Livin、p－p38MAPK表达与乳腺癌患者临床病理因素的关系Table 1 The correlation of Livinand p－p38MAPK protein with clinicopathological features of patients with breast cancer

3.Western blot检测结果

Western blot检测 Livin、p－p38MAPK 蛋白分别在约33kD和43kD处出现染色条带（图3）。其结果显示，20例乳腺癌组织中有13例检测出Livin蛋白的表达，阳性占65.0%；有12例检测出pp38MAPK蛋白的表达，阳性占60%。其结果与免疫组化结果基本一致。进一步对其定量检测结果进行灰度测定和分析，分析结果显示，乳腺癌组织Livin、p－p38MAPK／β－actin相对表达量分别为0.87±0.23；0.92±0.18；癌旁组织为0.28±0.12；0.13±0.08。乳腺癌组织 Livin、p－p38MAPK 蛋白表达水平均显著高于其相对应的癌旁组织（P＜0.05）。

4.乳腺癌组织中Livin和p－p38MAPK蛋白表达的相关性分析

Livin和p－p38MAPK蛋白在70例乳腺癌组织中均表达阳性者31例，均阴性表达者16例；45例Livin表达阳性的乳腺癌组织中，p－p38MAPK表达阳性率为68.9（31／45）；25例Livin表达阴性的乳腺癌组织中，p－p38MAPK表达阳性率为36%（9／25）。经Spearman相关分析得到：Livin与p－p38MAPK蛋白在乳癌组织中存在正相关关系（r＝0.318，P＝0.008，表2）。

图3 Livin、p－p38MAPK在乳腺癌及癌旁组织中的表达（Western blot法）T：乳腺癌组织，N：癌旁组织Fig.3 The expression of Livin and p－p38MAPK proteins was examined in breast cancer and para－cancerous tissues by Western blot.T：breast cancer tissues N：para－cancerous tissues

表2 Livin和p－p38MAPK表达的相关性分析Table 2 The correlation analysis of Livin and p－p38MAPK proteins in breast cancer

讨 论

细胞凋亡是维持细胞内环境稳定的重要环节，凋亡受阻可导致肿瘤的发生发展。Livin是2000年发现的 凋 亡 抑 制 因 子 （inhibitor of apoptosis protein，IAPs）家族的新成员，能够与凋亡蛋白酶结合，抑制其所介导的细胞凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一［3］。Wang等［4］检测的结直肠癌Livin表达增强，结直肠腺瘤Livin表达水平降低，而在正常结直肠黏膜中未见其表达。Livin与结直肠癌浸润深度有关。Li等［5］敲除Livin可抑制MDA－MB－231乳腺癌细胞的生长、增殖。而Livin过表达则引起MCF－7细胞迁移和侵袭能力的增强。这些资料显示，多种肿瘤中存在Livin的过表达，且表达水平的高低与肿瘤的恶性程度有关。

p38MAPK是丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族的重要成员，多种细胞外刺激可引起p38MAPK磷酸化后而被激活，活化后的p38MAPK（p－p38MAPK）转移至细胞核内，激活其下游的多种转录因子，不仅参与炎症、应激等多种反应过程，而且在细胞凋亡、增殖、分化、迁移等过程中起着举足轻重的作用，被认为是多种信号通路的中转站［6］。p38MAPK信号通路的活化可抑制细胞的凋亡，促进细胞的增殖、迁移，在肿瘤的发生发展及演进过程中也起重要作用。目前，在结直肠癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中均检出p－p38MAPK 的过度表达［7－9］。

本研究通过免疫组织化学和Western blot检测发现：Livin、p－p38MAPK蛋白在乳腺癌组织中的表达均高于对照组的癌旁乳腺组织，提示Livin、pp38MAPK蛋白的高表达可能与乳腺癌的发生有关。进一步分析两种蛋白表达与乳腺癌患者临床病理相关指标间的关系发现，Livin、p－p38MAPK蛋白在TNM分期高和淋巴结转移的乳腺癌患者中表达水平高于TNM分期低和无淋巴结转移的患者，提示Livin、p－p38MAPK可能参与乳腺癌的发展演进甚至淋巴结转移等过程。此外，Livin和pp38MAPK相关性分析显示，两者在乳腺癌组织中表达呈现正相关（r＝0.318，P＝0.008）。Myung等［10］报道，敲除Livin后可明显阻断MAPK信号通路，抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭；对照组Livin高表达使癌细胞的迁移和侵袭能力增强，同时凋亡减少。Qu等［11］用RNA干扰技术降低Livin的表达，引起磷酸化p38MAPK表达降低，进而降低MMP－2、VEGF表达，从而抑制了胃癌细胞增殖活性和侵袭能力。由此我们推测，Livin可能通过激活p38MAPK信号通路诱导乳腺癌的发生，并共同参与乳腺癌的发展演进过程。

综上研究结果，我们认为，Livin、p－p38MAPK在乳腺癌的发展演进过程中可能起着不可忽视的作用，并且两者可能存在一定的调控关系，其在乳腺癌中的具体调控机制以及两者的关系还有待进一步的实验证实。

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