重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP对肺癌细胞A549的体外实验研究

黄 琼 陈志雄 陶 琳 马红梅

（1武汉大学人民医院眼科；2武汉大学人民医院老年病科湖北430060）

肺癌是一种恶性肿瘤疾病，它严重影响着人类健康。多种肿瘤抑制基因缺失的现象常出现在癌组织中。PTEN基因是一个抑癌基因，它既是第一个被研究人员发现的具有磷酸酶活性的抑癌基因，又是唯一的具有磷酸酶活性的抑癌基因。研究发现PTEN具有双专一性的磷酸酶活性，PIP3／PKB信号传导可以被它所具有的PIP3磷酸酶活性所抑制，进而促进细胞发生凋亡，或者使细胞生长停滞在Gl期［1－4］。此外PTEN基因还通过其与张力蛋白同源的序列，参与细胞之间的信号转导，还参与了细胞骨架的重组［5，6］。

为研究PTEN基因，我们成功构建了重组腺病毒 Ad－PTEN－EGFP。重组腺病毒 Ad－PTEN－EGFP既携带了PTEN基因，又有绿色荧光表达基因存在，这样有利于我们对PTEN基因进行体内及体外的实验。本实验选择了肺腺癌细胞株A549，对重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP对肺癌细胞作用进行研究，为进一步体内的实验研究提供理论依据。

材料和方法

1.实验材料

1.1 细胞株人肺腺癌细胞株A549，购自武汉大学医学院肿瘤研究所。

1.2 重组腺病毒 Ad－PTEN－EGFP

为携带PTEN基因及含EGFP绿色荧光表达基因的重组腺病毒，第一部分方法制备，滴度为1.0×109pfu／ml。

2.主要试剂

DMEM、RPMI1640、胎牛血清均购自GIBCO公司；兔抗人PTEN多克隆抗体及羊抗兔HRP标记IgG均购自武汉博士德公司；Tripure提取液购自武汉康博生物技术公司；RT－PCR试剂盒购自武汉亚法生物技术有限公司；PTEN引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

3.实验方法

3.1 A549细胞的培养

均用 Hanks＇或0.02%EDTA；均冲洗两次，加入一定量的消化液（0.25%胰酶＋0.02%EDTA），在显微镜下进行观察，待细胞形态大部分变成圆形时，吸去废弃的消化溶液，加入一定量的新培养液，反复吹打A549细胞，直到细胞全部悬浮起来，然后加入新的培养液进行分瓶予以培养。注意每日在显微镜下观察A549细胞在培养瓶中的生长状态。

3.2 重组腺病毒感染A549细胞后镜下观察

由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1∶1，10∶1，100∶1，1000∶1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1∶1000的Polybrene。在37℃温度下平板离心30min；感染8－12h后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸中，加入适量全培液。同时需统计被重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP感染的肺癌细胞A549占总细胞数的百分比。

3.3 RT－PCR检测PTEN mRNA表达

将同等剂量的重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP以及对照组：腺病毒Ad－EGFP分别感染人肺癌A549细胞（1×106／ml）成功后，提取各组RNA。

（1）每1ml Trizol中溶1×106人肺癌A549细胞，然后加入0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15s，使其充分混匀，室温静置5min后12000rmp离心15min。（2）RNA 的沉淀；（3）RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次然后7500rmp离心5min。（4）RNA的再溶解；（5）RNA的保存；（6）cDNA 的合成；（7）引物设计：参照相关文献引物设计，由上海英骏生物技术有限公司合成PTEN引物：

PTEN引物1）PTEN基因的上游引物

P3 5＇－CCGGAATTCACCATGACAGCCATC－3＇

2）PTEN基因的下游引物

P4 5＇－GCGTCGACTTATCAGACTTTTGTA －3＇

（8）RT－PCR参照TaKaRa试剂盒说明：

反应体系如下：

l dNTPs 10mmol／L 0.5μl p3 25μmol／L 0.5μl p4 10μmol／L 0.5μl Taq polymerase 1μ／μl 0.5μl cDNA － 2μl ddH2O － 18.5μl总体系 25μ成分 浓度 体积PCR buffer 10× 2.5μ l

4.Western blot方法鉴定三组 A549细胞中PTEN蛋白的表达

设置三组：A 组，重组腺病毒 Ad－PTEN－EGFP；B组，感染Ad－EGFP；C组，加入PBS溶液。感染48h后，收集3组细胞，进行 Western blot方法鉴定PTEN蛋白的表达情况。

5.统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行分析处理，实验数值均以均数±标准差表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较用方差分析，P＜0.05为有显著性差异。

结 果

1.重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP对肺癌细胞A549的体外感染后细胞的形态

倒置显微镜下观察，经重组腺病毒Ad－PTENEGFP感染48h后，发现部分A549细胞的贴壁能力开始减弱，细胞形态开始变圆，体积缩小，出现核固缩现象。Ad－EGFP组及PBS组细胞生长正常，经重组腺病毒 Ad－PTEN－EGFP和 Ad－EGFP感染24h后，均可发现细胞有绿色荧光表达。转染效率均在50%以上（图1－4）。

图1 A549细胞（48h，倒置显微镜下观察）图2 Ad－EGFP感染A549细胞（48h，倒置显微镜下观察）图3 Ad－PTEN－EGFP感染A549细胞（48h，倒置显微镜下观察）图4 Ad－PTEN－EGFP感染A549细胞（24h，荧光显微镜下观察）Fig.1A549cell（48h，under inverted microscope observe）Fig.2Ad－EGFP infection A549cell（48h，under inverted microscope observe）Fig.3Ad－PTEN－EGFP infection A549cell（48h，under inverted microscope observe）Fig.4Ad－PTEN－EGFP infection A549cell（24h，under the fluorescence microscope observe）

2.RT－PCR方法检测PTENmRNA在A549细胞中的转录

为了检测将重组腺病毒转入肺癌A549细胞后，RT－PCR 法检测可发现 Ad－PTEN－EGFP组有1236bp左右的条带出现（图5），而对照组Ad－EGFP组细胞无条带出现。

图5 RT－PCR方法检测PTEN mRNA在A549细胞中的转录，左侧泳道为1000bp DNA Marker，中间泳道为感染重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP的A549细胞，右侧泳道为对照组Ad－EGFP细胞。Fig.5PTEN mRNA was detectied in transcription of A549cells by RT－PCR method，on the left side of the lane was 1000bp DNA Marker，the middle lane for infection of recombinant adenovirus Ad－PTEN－EGFP A549cells，on the right side as control group for Ad－ EGFP cell lane.

3.Western blot方法检测PTEN蛋白在A549细胞中的表达

Western blot方法检测可发现 Ad－PTEN－EGFP组SDS－PAGE中有55kDa条带产生，符合PTEN蛋白的表现，而其他两组均无此特异性条带产生（图6）。

图6 Western blot方法检测各组PTEN蛋白的表达Fig.6Western blot method to detect each group the expression of PTEN protein

4.重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP抑制肺癌细胞A549细胞的增殖检测

应用MTT法检测重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP转染A549细胞后对其生长的影响。MTT检测结果显示：以 MOI＝100转染不同时间（24、36、48、60、72、84、96h），Ad－PTEN－EGFP能够明显抑制A549的增殖速度（P＜0.05或P＜0.01），而 Ad－EGFP组则无明显抑制作用（图7）。

注：Ad－PTEN－EGFP 组 与 PBS 组 和 Ad－EGFP 组 比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01图7 重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP不同时间点转染A549细胞后对其生长的影响Fig.7Recombinant adenovirus Ad－PTEN－EGFP different time points after transfection A549cells to its growth influence

5.流式细胞仪分析重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP转染对A549细胞凋亡率的影响

Ad－PTEN－EGFP、Ad－EGFP、PBS 三 组 对 A549肺癌细胞的凋亡率分别为（17.9±2.4）%、（2.8±0.8）%和（2.6±0.6）%。Ad－PTEN－EGFP组凋亡率明显高于其他两组（P＜0.05）（图8A，B，C）。

图8 流式细胞仪检测转染后细胞凋亡的情况Fig.8Flow cytometry to detect cell apoptosis after transfection

讨 论

自1997年来，先后在美国三个实验室里，研究人员发现了一个肿瘤抑制基因，分别被命名为PTEN，TEP1和MMAC1，此基因定位于人类基因组的10q23［7］。在对人类大多数的肿瘤组织检测中，研究人员都发现PTEN基因出现失活的现象［8］。研究表明，离体肿瘤细胞的活动度可以被野生型PTEN基因明显的抑制，将外源性PTEN基因转染到细胞内，引起该基因的过度表达，这样可以使胶质母细胞瘤细胞系的增殖受到抑制［9］。近几年来，基因治疗恶性肿瘤已经成为研究人员的研究热点。在基因治疗过程中，影响基因治疗疗效的关键有二点［10－12］：①合适的目的基因；②选择基因高效的转移载体。腺病毒感染宿主细胞的种类比较广泛，它既可以使分裂期的细胞受到感染，又可以使非分裂期的细胞同样受到感染，高滴度的病毒容易被制备出来此外，大片段的外源性基因可以插腺病毒基因中，而在受染细胞内，腺病毒基因不和宿主的基因序列发生整合现象，因此腺病毒不具有致癌以及致突变等危险［13］。对于呼吸道上皮而言，腺病毒有天然的亲嗜性，具有器官和组织的特异性，因此将腺病毒运用于肺癌的基因治疗是非常合适的［14－16］。

为了研究PTEN基因的功能，我们成功构建了含有PTEN基因和绿色荧光表达的EGFP基因的重组腺病毒载体。通过多种实验方法（RT－PCR，Western blot等）证实：转染肺癌A549细胞后，重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP在该细胞中能够正确转录，蛋白表达。Ad－PTEN－EGFP，Ad－EGFP及PBS对照组分别感染A549细胞，倒置显微镜下，48h内观察各组细胞生长情况，我们发现，Ad－PTEN－EGFP组细胞的贴壁能力明显开始减弱，细胞形态从狭长状态逐渐开始变圆滑，而细胞体积则变得较小，有些细胞甚至出现核固缩的异常现象。而Ad－EGFP组及PBS组细胞生长正常，从显微的观察我们可以认为Ad－PTEN－EGFP具有一定影响细胞生长的作用。实验中，在感染重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP的细胞中可检测到PTEN蛋白和基因的表达，上述结果证明已构建成功的重组腺病毒能成功表达PTEN。

有研究证实：PTEN mRNA以及PTEN蛋白的缺失表达，主要在肿瘤的进展期发生，这种现象与肿瘤的恶性程度、转移等现象有着密切的联系［17－19］。MTT法可用来检测重组腺病毒对细胞的增殖抑制情况。本实验发现：Ad－PTEN－EGFP 转染肺癌A549细胞后，较对照组重组腺病毒具有显著的抑制细胞增殖的作用（P＜0.05），且抑制增殖的作用与转染的时间呈现正相关关系。

PTEN基因主要依靠MAPK途径和PIP3途径发挥生理作用，在MAPK途经中，PTEN基因能明显抑制MAPK途径上游ERK、RAS的活化和Shc的磷酸化过程，进而对细胞外信号调节激酶（ERK）／丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号途径起着负调节的作用，并且PTEN基因还能抑制MAPK激酶的磷酸化过程，阻滞细胞周期，使之处于细胞周期的G1期，抑制肿瘤细胞的生长过程［20－22］。PTEN 在 PIP3途径中则起到对抗 PI3K的生理作用，从而使得PIP3去磷酸化，阻止PI3K调控的信号转导通路，进而降低PIP3的表达水平，同样使得细胞停止在细胞周期的G1期，从而诱导和促进肿瘤细胞的凋亡。

通过流式细胞仪对重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP的细胞凋亡率进行检测和分析。本实验结果显示，重组腺病毒转染A549细胞后，细胞凋亡率明显增加，而Ad－EGFP组及PBS组凋亡率则较低，两者有明显的差异 （P＜0.05）。PTEN的这种诱导细胞发生凋亡的具体机制尚不清楚。

综上所述，通过体外实验，证实重组腺病毒Ad－PTEN－EGFP能改变肺癌A549细胞的细胞形态，转录并且有效的表达PTEN基因和蛋白，具有诱导和促进A549细胞发生凋亡的作用。

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