Pokemon和MDM2在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义

马 莉 柴大敏 李红伟 冯振中 张 琼 陶仪声＊

（1蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室；2蚌埠医学院第一附属医院放疗科 安徽233003）

食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，在我国以鳞状细胞癌多见。此肿瘤早期症状不明显，多数病人发现已属晚期且肿瘤易发生局部浸润和远处转移。目前研究的重点已经转移到与食管鳞癌预后判断有关的基因改变。Pokemon基因即POK红系髓性致癌物质，是转录抑制剂POK家族的一个重要成员，由zbtb7编码而成的POKemon蛋白参与一系列调节细胞基因转录的活动，并且在细胞分化过程中也发挥着非常重要功能［1］。鼠双微染色体2（murine double minute 2，MDM2）是一种凋亡抑制蛋白基因，位于人第12号染色体长臂（12q13－14）上，编码约1473bp核苷酸序列，其作用可促进细胞生长、抑制细胞凋亡，是目前发现最强的凋亡抑制因子［2、3］。Pokemon和 MDM2能在多种恶性肿瘤中表达升高，但两基因在食管鳞癌中的表达比较少见。本实验通过免疫组化研究Pokwmon和MDM2蛋白在食管鳞癌中的表达情况，分析其与临床各病理参数之间的关系，旨在寻找与食管鳞癌发生和发展相关的新的标记物。

材料和方法

1.一般资料

回顾性研究2006年1月到2007年12月蚌埠医学院第一附属医院手术切除食管鳞状细胞癌标本93例，另选取30例距离食管癌组织边缘5cm以上正常食管黏膜组织作为对照。所有患者术前均未做过放疗和化疗，并具有完整的临床资料及明确的病理诊断资料且经过患者及人体试验伦理道德委员会（蚌埠医学院）知情同意。其中男性77例，女性16例；＜55岁21例，＞55岁72例；高分化9例，中分化49例，低分化35例；临床分期Ⅰ＋Ⅱ期52例 ，Ⅲ＋Ⅳ期41例；有淋巴结转移54例，无淋巴结转移39例；浸润至浅层的39例，浸润至深层的54例。

2.试剂

兔抗人多克隆抗体Pokemon（Sc－66953，Santa Cruz）和 MDM2（Sc－7918，Santa Cruz）购自 Santa Cruz公司。通用性SP试剂盒及DAB显色试剂购自福州迈新公司。

3.实验方法及判定结果

采用免疫组织化学Elivision法对食管鳞癌和癌旁黏膜组织做Pokemon和MDM2染色，抗体滴度分别为1：200和1：100，具体步骤严格按照抗体说明书进行，用PBS代替一抗做阴性对照，选取试剂盒说明书已知阳性组织做阳性对照。Pokemon定位于ESCC的细胞浆及细胞核，呈浅黄色、黄色或棕黄色颗粒，MDM2主要表达于ESCC的细胞核为黄色或棕黄色颗粒。每张切片随机观察5个高倍视野，每个高倍视野计数100个细胞，结果评定采用双盲法。按照阳性细胞数并观察显色强度，按阳性细胞数所占得百分数评分：阳性细胞﹤5%为0分，5%－25%为1分，26%－50%为2分，51%－75%为3分，﹥75%为4分。细胞不着色为0分，浅黄色计1分，黄色计2分，棕褐色计3分。两者分数相乘0－1分为阴性，≥2分为阳性［4］。

4.统计学分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析，Pokemon和MDM2蛋白表达与临床病理学特征之间的关系用χ2检验，两基因之间的相关分析用Spearman等级相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Pokemon和MDM2蛋白在食管鳞癌及正常食管黏膜组织中的表达

Pokemon蛋白阳性表达定位于细胞核、细胞浆，在食管正常黏膜组织和鳞癌组织的阳性表达率分别为6.67%（2／30）和64.52%（60／93）（图1A－D），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。MDM2蛋白阳性表达定位于细胞核，在食管正常黏膜组织和鳞癌组织中的阳性表达率分别为20%（6／30）和58.06%（54／93）（图2A－D），两者差异具有统计学意义（P＜0.01表1）。

表1 Pokemon和MDM2蛋白在食管鳞癌及正常食管黏膜组织中的表达Table 1 The expression ofPokemon and MDM2protein in normal tissues and ESCC

图1 Pokemon蛋白在食管正常黏膜组织及食管鳞状细胞癌中的表达Fig.1he expression of Pokemon in esophageal mucosa and ESCC.A：Negative expression of Pokemon in normal esophageal mucosa（ElivisionTM：×100）.B：Negative staining of Pokemon in normal esophageal mucosa （ElivisionTM：×400）.C：Positive staining of Pokemon in cytoplasm and nucleus of ESCC （ElivisionTM：×100）；D：Positive staining of MCM2in cytoplasm and nucleus of ESCC （ElivisionTM：×400）.

图2 MDM2蛋白在食管正常黏膜组织及食管鳞状细胞癌中的表达Fig.2The expression of MDM2in esophageal mucosa and ESCC.A：Negative expression of MDM2in normal esophageal mucosa（ElivisionTM：×100）.B：Negative staining of MDM2in normal esophageal mucosa（ElivisionTM：×400）.C：Positive staining of MDM2in the nucleus of ESCC（ElivisionTM：×100）；D：Positive staining of MCM2in the nucleus of ESCC（ElivisionTM：×400）.

2.Pokemon和MDM2蛋白的表达与ESCC患者临床病理参数之间的关系

在食管鳞癌中Pokemon蛋白的阳性随淋巴结的转移及临床分期的增加而表达增强（P＜0.05），而与患者的年龄、性别、组织学分级和浸润深度等无关（P＞0.05）。MDM2蛋白的表达与食管鳞癌的组织学分级、淋巴结转移及临床病理分期有关（P＜0.05），而与患者的性别、年龄和浸润深度均无显著相关性（P＞0.05）见表2。

表2 食管癌中Pokemon和MDM2蛋白的表达水平与临床病理参数之间的关系Table 2 The relationship between the expression of Pokemon and MDM2and clinicopathological parameters of patients with in ESCC （n＝93）.

3.Pokemon和MDM2蛋白在食管鳞癌中表达 的相关性研究

Spearman等级相关分析显示，在食管鳞癌组织Pokemon和MDM2都阴性的25例，Pokemon阴性而MDM2阳性的8例，Pokemon阳性而MDM2阴性的14例，Pokemon和MDM2均阳性的46例，在食管鳞癌中Pokemon和MDM2蛋白表达呈正相关r＝0.508（P＜0.05）见表3。

表3 Pokemon和MDM2蛋白在食管鳞癌中表达的相关性研究Table 3 Correlation of Pokemon and MDM2in ESCC（n＝93）

讨 论

食管癌是常见的消化系统肿瘤之一，在我国其发病率及死亡率呈逐年升高趋势，尤其食管鳞癌早期临床症状不明显，患者手术后容易复发或远处转移。研究表明食管癌的发生与原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。Pokemon基因是一种原癌基因，可以调节多种癌基因及抑癌基因的活性，被认为是肿瘤发生的总开关。目前研究最多的是Pokemon基因可以调节ARF从而调节MDM2的表达，促进肿瘤的发生。但国内至今未见Pokemon和MDM2基因同时在食管癌中表达的研究报道。

Pokemon基因是转录抑制因子Pok家族的重要成员之一，首先被发现它是作为人类免疫缺陷病毒－1的转录诱导连接因子。Pokemon基因定位于人染色体19p13.3，具有BTB／POZ结构域和锌指结构，由2个外显子和2个内含子构成，其中包括一个开放阅读框架，此基因编码由584个氨基酸构成的蛋白［5］。一方面Pokemon基因能够特异性抑制癌基因ARF的活性，促进MDM2过表达，从而抑制野生型p53的活性，促进肿瘤的发生、发展［6］。另一方面它还可以调节多种信号通路。如抑制Rb基因转录，抑制NF－κB从细胞核进入细胞浆及上调survivin活性，抑制细胞凋亡等［7－9］。目前Zu等研究发现Pokemon基因在乳腺癌中表达明显高于正常乳腺组织，且与肿瘤的大小、淋巴结转移情况及临床预后相关，一并发现Pokemon基因可以上调survivin基因活性，抑制肿瘤细胞的凋亡［9］。Zhao等［10］也发现Pokemon基因在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁对照组织，通过临床参数比较发现Pokemon基因与肿瘤病人的TNM分期和存活时间紧密相关，并且可调节ARF的表达，促进肺癌的发生。

研究发现Pokemon基因在食管正常黏膜组织中的阳性表达率为6.67%，在食管鳞癌组织中的阳性表达率为64.52%，两者差异具有统计学意义（P＜0.01）。说明在食管正常黏膜组织中存在少量Pokemon基因的表达，而在食管鳞癌中Pokemon基因确实高表达，Pokemon基因可能在食管鳞癌的发生过程中起重要作用。这与Aggarwal等［11］在乳腺癌中的报道一致。实验还发现，在食管鳞癌组织中有淋巴结转移的患者Pokemon蛋白的表达比没有淋巴结转移患者的表达率增加，可能Pokemon基因推动了食管鳞癌的发生、发展，参与肿瘤细胞的转移。此外临床分期越高的病人Pokemon蛋白的表达越强，因此Pokemon基因可能会作为食管鳞癌判断预后的又一分子标记物，但具体作用机制还有待于进一步研究。

MDM2，即鼠双微染色体2基因是最近发现的一种凋亡抑制蛋白基因，位于人12号染色体12q13－14上，MDM2基因与p53基因存在着相互调节作用，一方面p53基因在一定条件下可以促进MDM2的转录，另一方面MDM2编码的蛋白质可以与野生型p53蛋白结合，抑制p53功能，使停留在G1期的细胞重新进入细胞周期，促进细胞的增殖活性。在肿瘤的发生发展过程中MDM2基因主要由后一种作用为主［12］。研究发现，在肺癌、乳腺癌及脂肪肉瘤等多种恶性肿瘤中有MDM2蛋白的高表达，且与肿瘤的发生、发展、预后及无病生存期密切相关［13－15］。

本研究发现MDM2定位于细胞核，在鳞状细胞癌中的表达水平（58.06%）显著高于正常组织（20%）；MDM2可以抑制野生型p53的活性，阻止细胞凋亡，促进细胞增殖，因此MDM2在食管鳞癌发生、发展过程中发挥重要作用。本实验还通过临床各病理参数比较，发现随着食管鳞癌分化程度增加MDM2蛋白的表达增加，淋巴结转移者比没有淋巴结转移者MDM2蛋白表达增强，食管鳞癌Ⅲ＋Ⅳ患者MDM2蛋白的表达率明显高于Ⅰ＋Ⅱ其患者，与李祖飞等［16］报道喉鳞癌中MDM2表达结果较一致。分化程度、淋巴结转移及临床分期是临床判断肿瘤生物学行为及预后的重要指标，随着分化程度越高、临床分期越高及有淋巴结转移，MDM2蛋白的表达率增加，提示临床预后较差，因此MDM2可作为临床判断预后的又一参考指标。

Pokemon蛋白的高表达可以抑制ARF的活性，导致ARF的抑癌作用较低，并且ARF又可以调节MDM2的活性，ARF的低表达可以引起MDM2的表达活性增强，MDM2又可以调节p53的活性，MDM2的表达增强可以引起野生型p53表达的减少，而突变型P53表达活性的增强，引起肿瘤的发生，这 就是所谓的 Pokemon－p14ARFMDM2－p53调节通路［17］。我们研究发现在食管鳞癌中Pokemon和MDM2蛋白表达呈正相关，进一步证实了Pokemon和MDM2的相协调互作用关系。

综上所述，Pokemon和MDM2蛋白在ESCC患者中表达增强，两基因协调作用共同促进ESCC的发生、发展和转移。联合检测两基因在ESCC患者中的表达情况有助于判断患者的预后。Pokemon作为调节通路中的重要基因，可望通过抑制其表达达到治疗ESCC的目的，为ESCC的靶向治疗提供新的靶点。

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