楚雄腮扁叶蜂虫生真菌的分离鉴定及其致病性

夏举飞，陈玉惠，李永和，刘建宏，徐荣，周航

(1．西南林业大学林学院，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224;2．西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224)

楚雄腮扁叶蜂Cephalcia Chuxiongica Xiao隶属于膜翅目Hymenoptera扁叶蜂科Pamphiliidae腮扁叶蜂属Cephalcia，以幼虫危害云南松Pinus yunnanensis、华山松P．armandii、云南油杉Keteleeria evelyniana、雪松Cedrus deodara等松科植物的针叶［1］，受害重的林分，针叶几乎被取食殆尽，树上挂满幼虫吐丝把虫粪和针叶碎屑连结而成的幕巢，影响林木的光合作用和木材蓄积量，严重时导致林木枯死［2-4］。楚雄腮扁叶蜂在云南主要分布于楚雄、昆明、曲靖、文山等地，并呈进一步扩散蔓延之势［3］;目前关于该虫防治方面的研究报道较少，据马苹 等报道，在基层生产中主要采取人工摘除幕巢烧毁、翻挖幼虫和蛹的方法防治;但这些方法不仅费工费时、破坏土表植被，而且难以做到有效而可持续控制［2］。利用虫生真菌防治害虫，已成为以生物防治为主导的综合治理重要途径之一，虫生真菌也是害虫种群自然调节的重要因子和害虫生物防治的重要材料［5］。但至今未见关于楚雄腮扁叶蜂生物防治方面的研究报道。本研究在野外自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂幼虫上分离到5株楚雄腮扁叶蜂幼虫的致病菌，并测定了其对楚雄腮扁叶蜂幼虫的致病力，以期为楚雄腮扁叶蜂生物防治提供菌种资源和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源2014年7月在云南省寻甸县(N 25．30°，E 103．21°、海拔1970 m)云南松和华山松混交林内，采集土中具有典型症状的自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂幼虫尸体标本，分别装入灭菌的离心管内带回实验室。2014年11月于寻甸县林内采集健康楚雄腮扁叶蜂幼虫，用于回接验证试验。

1.2 菌株分离采用组织分离法［6-7］，将虫尸用75%酒精棉球表面擦拭消毒后，用灭菌小刀切成米粒大小的虫体组织，依次浸入75%的酒精中3 s，0．1%升汞消毒30 s，无菌水清洗3次，接入含青霉素0．05%的PDA(马铃薯:200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1000 mL)培养基中。每皿培养基接3块，置于(25±1)℃恒温培养箱内培养，接种后的第2天开始观察，每天1次，适时挑取虫体组织周围新长出的少许幼嫩菌丝进行分离纯化，直至分离出纯菌落后保存、备用。

1.3 菌株的回接验证及再分离对分离纯化得到的菌株扩大培养，待其充分产孢后，用0．05%的吐温-80水溶液洗下孢子，用涡旋振荡器充分振荡，使孢子尽可能分散，然后配制成1．5×108孢子/mL孢子悬浮液，用浸渍法［8］将各菌株的孢子接种到经无菌水冲洗3次的健康楚雄腮扁叶蜂幼虫体表，每个菌株接种20头健康幼虫，并用0．05%吐温-80水溶液处理作对照。将接种幼虫放入灭菌的试管(12 mm×70 mm)中，用无菌脱脂棉加无菌水保湿，并用干燥的无菌棉塞封口，置于(25±1)℃恒温培养箱内培养，每天定时观察记录各菌株对楚雄腮扁叶蜂幼虫的感染和致死情况。

从长出菌丝的楚雄腮扁叶蜂幼虫体表，挑取少量菌丝于PDA平板上，置于(25±1)℃恒温培养箱内培养，经纯化获得纯菌落后与供试菌株进行培养性状和形态结构的比对，筛选出符合柯赫氏法则［6］且对楚雄腮扁叶蜂幼虫具有致病性的菌株，排除从楚雄腮扁叶蜂幼虫上分离到的非致病菌株。

1.4 致病菌株的鉴定

1.4.1 培养性状观察 将分离纯化得到的菌株，取直径为5 mm的菌块接种于查氏培养基(NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KCl 0．5 g，FeSO4·7H2O 0．01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL)上，置于25±1℃恒温培养箱内培养14 d后，观察、描述其培养性状并拍照。

1.4.2 形态结构观察 采用改进的小培养法［8］培养各菌株。在超净工作台内将切取的2块1．5 cm×1．5 cm×1 mm大小的查氏培养基置于无菌载玻片上，用接种针蘸取少许菌株孢子接种于培养基一端，盖上盖玻片后，将载玻片置于无菌培养皿内的2根玻璃棒上，培养皿底部垫1层加入适量无菌水的脱脂棉和滤纸以保湿，最后盖好皿盖，置于25±1℃恒温培养箱内培养，从第3天开始每天定时在光学显微镜下观察菌丝的生长及显微结构并拍照。

1.4.3 分子鉴定 将致病菌株在PDA平板上培养1周，刮取菌丝，采用CTAB法［10］提取DNA，ITS序列测定引物为通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')［11］，扩 增 反 应 体 系(50μL):ddH2O 36μL，10×KOD buffer 5μL，2 mmol/L dNTPs 5μL，10μmol/L的ITS4和ITS5各1μL，KOD酶1μL。扩增程序:94℃反应3 min;94℃反应30 s，58℃反应30 s，72℃反应3 min，35个循环;72℃反应10 min。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，确定有特异扩增后，再扩增1个50μL体系的PCR并进行PCR产物回收。回收后再用1%琼脂糖凝胶检测DNA。为了数据更加准确，选取条带清楚的PCR样品经切胶纯化，送往北京信诺金达生物科技有限公司直接测序。

1.5 菌株的致病性将致病菌株进行扩大培养，并按1．3的方法进行孢子悬浮液的配制、接种、培养及观察记录，每个致病菌株同样接种20头健康幼虫，并用0．05%吐温-80水溶液处理作对照组，观察记录直至第16天。

1.6 数据处理数据应用Excel和SPSS16．0数据处理系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果经分离和纯化，从楚雄腮扁叶蜂自然罹病死亡的幼虫尸体上分离得到15株真菌，鉴定到属的12株，分别属于10属;未产孢尚不能判断其分类地位的有3个菌株。各菌株的编号及分类地位见表1。

2.2 菌株的回接验证及再分离15个菌株回接验证试验结果表明，有5个菌株(SWYH01，SWYH02，SWYH06，SWYH07，SWYH09)能够成功感染楚雄腮扁叶蜂幼虫，接种3d后均能观察到在接种幼虫体表长出的白色菌丝，以及幼虫表现出反应迟钝、行动迟缓、体色变化等症状，接种16 d后的僵虫数见图1。再分离结果显示，接种虫体上长出的菌丝体与原接种菌株培养性状和形态结构均相同，进一步表明这5株菌均是楚雄腮扁叶蜂幼虫的致病性虫生真菌。

表1 分离得到的菌株编号及其分类地位

图1 幼虫被不同菌株感染后的僵虫数

2.3 致病菌株鉴定结果

2.3.1 培养性状及形态鉴定 5株致病菌在查氏培养基上培养14 d后的形态特征(图2)描述如下。

菌株SWYH01 菌落直径42 mm，较薄、平坦、绒状至粉状;正面白色或黄色，反面淡黄色，培养基无色;产孢细胞基部膨大，球形、近球形，大小(2．5～4．0)μm×(2．8～3．6)μm，向上变细为1～2μm的“Z”形产孢轴，可单生或聚生于菌丝上;分生孢子椭圆形(3．1～5．8)μm×(2．6～3．1)μm、近球形(1．3)2．0～3．5(4．0)μm。

菌株SWYH02 菌落直径60 mm，疏松绒状或粉状，平展，表面具有肉色凸起小颗粒，具有3个明显的轮层;正面紫灰色或淡紫色，反面米色或淡紫色，培养基无色;分生孢子梗(7．5～13．0)μm×(2．0～3．0)μm，长短差异大;轮生体由3～6个产孢细胞组成，产孢细胞基部呈柱状膨大或不膨大，顶部细，孢子呈链状排列。分生孢子椭圆形或近椭圆形，2．0～3．0(4．0)μm。

菌株SWYH06 菌落直径60 mm，絮状，由内向外厚薄不均，表面有明显小液滴;正面白色或淡黄色，反面淡黄色，培养基无色;产孢细胞拟青霉型或轮枝孢型，单生或簇生于菌丝或分生孢子梗上;拟青霉型分生孢子梗明显，长短不一，(13．0～18．5)μm×(2．0～3．0)μm，基部膨大，向上逐渐变细，颈部细长，2～4个形成的轮生体着生于分生孢子梗上;轮枝孢型分生孢子梗(15．5～31．5)μm×(2．5～3．0)μm，不发达，似营养菌丝，其上有单生、对生或1～3个轮生的产孢细胞，纤细，基部膨大不明显，向上逐渐变细，颈部长;分生孢子粘结成头状，腊肠形(5．0～6．0(7．8))μm ×(2．5～3．0)μm，球 形(2．6～4．0(5．0))，椭圆形(4．5～7．0(7．8))μm ×(2．5～4．0)μm，卵形(4．0～5．5)μm×(2．5～4．0)μm。

菌株SWYH07 菌落直径45 mm，中央气生菌丝突起、疏松，向外气生菌丝减少、变薄;正面白色、淡黄色或橘黄色，反面橘黄色，培养基无色;分生孢子梗不规则分枝，长短不一，其上着生有2～4个产孢细胞组成的轮生体，产孢细胞(5．0～13．0)μm×(2．0～3．0)μm，基部拟椭圆形膨大，向上变细成明显的颈部。分生孢子呈链状排列，球形(2．0～3．0)μm或拟椭圆形(1．3～2．5)μm×(2．0～3．0)μm。

菌株SWYH09 菌落直径35 mm，内部疏松，边缘紧密突起;正面白色、乳白色或淡黄色，反面黄色或淡黄色，培养基无色;产孢细胞(4．0～11．5)μm×(3．0～4．5)μm，基部球形、近球形，多簇生于囊泡上，偶见直接着生于菌丝上;产孢轴纤细具齿突，长2．6～18．2μm，呈“Z”字形弯曲。分生孢子球形(1．3)2～2．9μm或近球形。

图2 各菌株的形态特征

通过培养性状及形态结构观察，结合中国真菌志第三十二卷［12］、第四十三卷［13］、第四十七卷［14］初步判定菌株SWYH01为白僵菌属Beauveria的布氏白僵菌B．brongniartii，SWYH02为拟青霉属Paecilomyces的淡紫拟青霉P．lilacinus，SWYH06为生赤壳属Bionectria的淡色丛赤壳B．ochroleuca，SWYH07为棒束孢属Isaria的粉质棒束孢I．farinosa，SWYH09为白僵菌属的球孢白僵菌B．bassiana。

2.3.2 分子生物学鉴定 将各菌株测得的ITS基因序列在NCBI上进行BLAST比对，发现菌株SWYH01与布氏白僵菌(JX110373．1和JX110374．1)的相似度均为98%;SWYH02与淡紫拟青霉(GU980015．1和HM242262．1)的相似度均为99%;SWYH06与淡色丛赤壳(GU112755．1和AB003950．1)的相似度均为99%;SWYH07与粉质棒束孢(AB233337．1和KC768083．1)的相似度均为99%;SWYH09与球孢白僵菌(JN379794．1和KC753398．1)的相似度均为99%。

结合该5株菌的培养性状和形态结构鉴定结果，确定菌株SWYH01为白僵菌属的布氏白僵菌，SWYH02为拟青霉属的淡紫拟青霉，SWYH06为生赤壳属的淡色丛赤壳，SWYH07为棒束孢属的粉质棒束孢，SWYH09为白僵菌属的球孢白僵菌。

2.4 菌株对楚雄腮扁叶蜂幼虫的致病性幼虫感染不同菌株后，体色变化基本相似，均由原来的鲜绿色逐渐变为黄色、淡黄色、深棕色或褐色，但不同菌株的孢子在虫体上的萌发速度及侵染部位有所差异，5个菌株中有4个菌株(淡色丛赤壳除外)的孢子主要侵染幼虫的头部、尾部和节间褶;而淡色丛赤壳菌株的孢子则主要侵染幼虫的气门处，并且孢子萌发速度最快，在接种的第2天便在幼虫的多个气门处观察到菌丝的生长。其它菌株则需3～4 d才能在虫体上见到菌丝。5个菌株接种幼虫后随着孢子萌发和菌丝的不断生长覆盖，虫体逐渐僵化死亡，有的虫体干瘪，失去原有形态(图3)。

图3 不同菌株感染后的楚雄腮扁叶蜂幼虫症状

5个致病菌株在接种浓度为1．5×108个/mL孢子时，对楚雄腮扁叶蜂幼虫均有一定的致病性，但致病力强弱有差异。致病力最强的是SWYH06，接种后16 d幼虫校正死亡率高达100%;SWYH02的致病力较弱，幼虫校正死亡率仅为43．64%。各菌株的致病性由强到弱依次为SWYH06，SWYH07，SWYH01，SWYH09，SWYH02。

表2 5个不同菌株对楚雄腮扁叶蜂幼虫的致病性测定结果

3 结论与讨论

野外采集样本的过程中，发现真菌对楚雄腮扁叶蜂的寄生主要发生在幼虫期。在云南省寻甸县楚雄腮扁叶蜂化蛹前和老熟幼虫下树入土1个月后，有些个体出现自然罹病死亡情况，发病初期先在头部、节间褶和气门处长出少量白色菌丝，虫体绿色;随时间推移，虫体表面菌丝生长量不断增加，白色菌丝覆盖范围不断扩大，最后整个虫体被一层厚厚的白色菌丝完全包裹或从虫体不同部位长出白色或黄色的孢梗束，虫体变僵，虫体颜色由原来的绿色变为黄色、深棕色或黑色。

本研究从楚雄腮扁叶蜂自然罹病死亡幼虫上分离的SWYH01(布氏白僵菌)、SWYH02(淡紫拟青霉)、SWYH06(淡色丛赤壳)、SWYH07(粉质棒束孢)、SWYH09(球孢白僵菌)5株虫生真菌为楚雄腮扁叶蜂幼虫的病原菌，其对楚雄腮扁叶蜂幼虫的室内感染方式与林内感染方式基本一致，除菌株SWYH06(淡色丛赤壳)主要从气门感染幼虫外，其余菌株均从头部、尾部、节间褶等部位感染幼虫。

据初步统计，全世界已知扁叶蜂科昆虫种类250种以上，中国已知腮扁叶蜂属的昆虫有19种［15］。从扁叶蜂科昆虫虫体上分离虫生真菌，国内外却鲜见报道，本研究从楚雄腮扁叶蜂自然罹病死亡幼虫虫体上分离虫生真菌尚属首次。采用形态和分子生物学方法对5株致病性真菌进行了鉴定。其中球孢白僵菌、布氏白僵菌、粉质棒束孢、淡紫拟青霉为有历史记载的昆虫致病菌［16］，而淡色丛赤壳在前人的相关研究中主要集中在植物内生真菌和真菌寄生菌等方面［14］，本文首次发现其对昆虫的寄生性和致病性，而且对楚雄腮扁叶蜂的室内致病力明显高于其他菌株，该菌株对楚雄腮扁叶蜂的防控有较大的开发应用潜力。但淡色丛赤壳的生物学特性、寄主范围和其在林内对楚雄腮扁叶蜂幼虫的防控效果还有待进一步研究。

志谢:本文在虫生真菌分离和形态鉴定中，得到西南林业大学周彤燊教授的指导和帮助，在此表示衷心的感谢。

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