酵母双杂交系统及其应用研究进展

崔红军， 魏玉清

(北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021)

酵母双杂交系统及其应用研究进展

崔红军， 魏玉清

(北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021)

酵母双杂交系统作为一种有效研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，具有真实、高效、敏感、广泛的特点，被广泛应用于诸如蛋白质组学、基因组学等领域。主要对酵母双杂交技术的原理、特点及应用现状进行了综述。

酵母双杂交系统；蛋白质相互作用；应用

蛋白质是细胞中的实际功能分子，具有负责细胞生物化学活性的功能，随着生物化学和分子生物学研究技术和手段的不断深入，蛋白质分子间的相互作用作为蛋白质组学研究的主要内容之一已成为近年来的研究热点。蛋白质互作不但能够提供蛋白质本身功能的信息，而且能够提供蛋白质在代谢调控、信号传导和复合体中起作用的信息[1]。筛选、分析蛋白质互作的方法有很多种，主要包括生物化学法，如共纯化、亲和纯化和免疫共沉淀，质谱技术，离子体共振技术，生物物理技术，噬菌体展示技术和酵母双杂交技术等[2]。目前，酵母双杂交技术当属研究蛋白质互作方法中较为高效、灵敏和简便的一种方法。

1 酵母双杂交系统的基本原理

酵母双杂交系统是由Fields等[3]根据真核转录调控的特点于1989年首次提出并建立，可直接于细胞内检测蛋白质的相互作用。其原理为：真核生物有上游激活序列(UAS)，在转录水平上进行基因的表达调控，如酵母转录因子GAL4含有2个或2个以上的结构域，其中包括2个极其重要且可以彼此分割开的结构域，DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和DNA转录激活结构域(Transcription- activating domain, AD)。BD识别并结合于效应基因上游激活序列，AD与BD结合成转录复合体，从而激活UAS下游报告基因的转录。AD和BD的单独存在并不能激活下游基因的转录作用，只有两者在空间上互相接近，下游报告基因才能得以表达。BD与表达已知蛋白X的基因片段连接，构建成BD-X质粒载体，AD与cDNA文库表达未知蛋白Y的基因片段或基因突变体Y连接，构建成AD-Y质粒载体，把蛋白X和Y分别称为诱饵蛋白(bait)和靶蛋白(prey)，将BD-X和AD-Y共同转化到酵母菌体内，此酵母菌体内有报告基因(LacZ、His、Leu、Trp、ADE等[4])而本身并无报告基因转录活性。当BD-X和AD-Y这2个融合蛋白表达并相互作用时，则在空间结构上将AD和BD拉近，从而形成转录因子，激活UAS下游报告基因的表达，使此转化体可以在His、Leu、Trp、ADE等特定营养缺陷培养基上生长，并由于LacZ报告基因的表达，酵母菌会分泌β-半乳糖苷酶，X-gal在β-半乳糖苷酶的存在下，会变成蓝色底物，从而使阳性菌落呈蓝色。当BD-X和AD-Y不融合时，下游基因不表达，据此分析判断2个蛋白是否相互作用。在目前通用系统中,根据BD来源不同可分为GAL4系统和LexA系统。真核细胞中是GAL4系统;原核细胞中是LexA系统,其转录启动因子是LexA。

2 酵母双杂交系统的研究历史

酵母双杂交系统在应用中得到不断改进和完善，并衍生出几个新的系统。1993年，Li等[5]提出酵母单杂交系统，在单杂交系统中无需转录激活结构域和诱饵蛋白的融合蛋白与DNA结合结构域和靶蛋白的融合蛋白结合来激活报告基因的表达，转录激活结构域融合蛋白可直接与特异DNA序列结合激活报告基因表达，单杂交系统是研究转录因子分离鉴定的有效方法[6]。1996年,Vidal等[7]提出反向酵母双杂交系统，即使用表达产物对酵母菌本身有毒性的报告基因，当诱饵蛋白和靶蛋白没有相互作用或者相互解离时酵母菌株能够正常生长。此双杂交模式更适用于研究蛋白质间作用位点或者利用抑制或阻断蛋白质间相互作用来寻找药物。1996年，Sengupta等[8]提出酵母三杂交系统，它与双杂交的不同在于激活结构域融合蛋白与结合结构域融合蛋白之间的相互作用需要第三组分的介导来完成，该组分可为RNA、蛋白质或小分子物质。1997年，Aronheim等[9]提出Sos招募系统，其原理为哺乳动物的Ras鸟苷酸交换因子Sos蛋白为一种胞质蛋白，酵母中其同源Ras鸟苷酸交换因子Cdc25蛋白定位于细胞膜上。Cdc25突变可产生温度敏感缺陷型细胞，使酵母菌株不能在37 ℃下生长，可将Sos蛋白定位在细胞膜上代替Cdc25蛋白的作用，激活Ras信号通路，恢复酵母菌株在37 ℃条件下生长的能力。酵母双杂交及其衍生系统在蛋白质与蛋白质间、蛋白质与核酸间以及蛋白质与其他小分子间互作的研究中起着举足轻重的作用。

3 酵母双杂交系统的主要特点

酵母双杂交技术可以精确地分析已知蛋白间的相互作用，以及筛选编码未知蛋白的基因，具有真实性、敏感性、高效性、广泛性等[10]特性。即便双杂交是检验蛋白质互作的有效方法，其自身也存在缺点，如易产生假阳性、假阴性等。

3.1 酵母双杂交系统的优点

(1)检测蛋白质的相互作用是在真核细胞内进行，在核酸水平上操作，避免了蛋白质的分离纯化过程，保证了蛋白质的活性，所以能更加真实地反映蛋白质互作情况。

(2)报告基因表达产物的积累，使双杂交技术能敏感地检测到蛋白质间微弱、暂时的作用。

(3)可以直接从cDNA文库中筛选与已知蛋白质相互作用的基因片段。双杂交技术应用广泛，可采用不同类型细胞构建cDNA文库，分析不同类型细胞的蛋白质功能。

(4)酵母菌有不同的标记基因：营养缺陷型基因、抗性基因，易于相互作用的蛋白质的筛选。

3.2 酵母双杂交系统的局限性及改进

(1) 假阳性。假阳性是酵母双杂交中的主要问题。由于某些蛋白质本身具有激活报告基因表达的功能，无需诱饵蛋白和靶蛋白的特异性结合，某些蛋白和空载体的结合也可激活转录系统，抑或是某些蛋白质表面有其他蛋白质的低亲和力区，易于激活报告基因的表达，产生假阳性现象。针对上述不足，研究者们对报告基因进行改进[11]，对其载体构建策略进行改进[12]等，提出双筛选系统和假阳性显示分析法，显著减少假阳性的产生。

(2) 假阴性。假阴性虽不是酵母双杂交中的主要问题，但仍需重视。其常见原因：一是两蛋白质间作用微弱使得报告基因不表达或表达量少而使其难以检测，对其进行改进应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。二是诱饵蛋白和靶蛋白融合体的表达对细胞有毒害作用，应选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体[8]。

(3) 核内反应。利用酵母双杂交研究互作蛋白质必须定位在细胞核内，这限制了核外蛋白质的研究。针对此现象，产生了Sos恢复系统[9]，将互作蛋白的研究场所转移到细胞质中。

(4) 此外，蛋白质转化率的高低是成败的关键。研究表明质粒转化过程中共转化比依次转化效率高[13]。

4 酵母双杂交系统的应用

酵母双杂交作为具有开创意义的研究方法，是研究蛋白质互作，蛋白质结构与功能的重要手段，目前已广泛应用于蛋白质与蛋白质间、蛋白质与核酸间以及蛋白质与其他小分子间相互作用的研究。该技术也可用于大规模蛋白质间互作的研究,具有易于自动化、高通量[14]等特点。

4.1 检测已知蛋白质间的互作建立酵母双杂交系统最初是为了研究已知蛋白间的互作。至今应用双杂交系统已证实了大量蛋白质间的相互作用。如已知玉米类pto和类ptil基因参与逆境胁迫的信号传导，邹华文等[15]利用双杂交技术初步确定只有Zmpto和Zmptil相互作用时才能激活报告基因的表达。柑橘衰退病毒(CTV)能引起柑橘衰退病，CTV编码的外壳蛋白CP和P20蛋白均存在自身互作，Chofong等[16]运用双杂交技术分析和GST-pulldown体外验证，表明P20氨基酸序列N端的1～21位氨基酸及CP氨基酸序列N端的41～84位氨基酸对自身互作具有重要作用。PML是与急性早幼粒细胞白血病(APL)发病机制相关联的蛋白质，包含PML的coild-coil结构域，命名为PML-C。2010年，朱丹等[17]从白血病cDNA文库筛选出包含CYPN2蛋白在内的9种与PML-C结构域相互作用的蛋白质，为阐明APL发病机制提供新的思路。2012年，吴秀娟等[18]利用酵母双杂交以及免疫共沉淀试验进一步验证PML-C和CYPN2之间的相互作用，PML-C和CYPN2作用形成的复合物可能影响CYPN2的正常功能，与APL发病有重要关系。

4.2 发现新蛋白及蛋白新功能酵母双杂交最重要的用途是从cDNA文库中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白[19]，继而研究蛋白互作效应。目前研究者应用双杂交系统已经发现许多新蛋白。如崔雨明等[20]利用酵母双杂交技术在人白细胞文库中筛选到8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白，为探索流感病毒致病机理指明了一定方向，提供一定理论基础。 GsCBRLK在 ABA 及盐胁迫诱导的钙离子信号通路中起着关键调节作用，为更加深入地研究GsCBRLK的作用机制，杨姗姗等[21]应用酵母双杂交筛选到SNARE和14-3-3两种与GsCBRLK互作的蛋白。独脚金内酯(SLs)是一种抑制植物分枝的新型激素，其合成及信号传导途径尚不清楚，王涛[22]以多个水稻矮化多分蘖突变体包为试验材料研究SLs，利用酵母双杂交等方法筛选到与SLs信号途径中D3和D14互作的蛋白质，为阐明SLs调控水稻分蘖、植物分枝的作用机制奠定了理论基础。为明确不结球白菜 Pol胞质雄性不育相关基因的信号传递通路,钱瑜等[23]构建了不结球白菜Pol胞质雄性不育花酵母双杂交cDNA文库，筛选到与细胞色素C还原酶铁硫蛋白( BCRISP1)互作的蛋白CYP81G和PIP2。

4.3 筛选多肽类药物及寻找药物作用位点分子间相互作用可能导致疾病的产生，研究表明，多肽类药物对治疗癌症和病毒类等疾病最有效。利用酵母双杂交技术筛选与来源于肿瘤、细菌及病毒的蛋白间相互作用的多肽类药物，分析疾病发生机理，确定药物互作蛋白在肿瘤、细菌及病毒中的位置，有目标性地干扰疾病蛋白的表达，已达到治疗疾病的预期效果。Waheed等[24]利用细菌逆向双杂交筛选出一种细胞周期蛋白，可干扰Gag蛋白与TsG101的结合，阻断 HIV-1在宿主内的出胞过程。秦咸蕴[25]运用双杂交筛选出引起手足口病的肠道病毒EV71的抑制活性中药，为治疗肠道病毒疾病提供了理论基础。人巨细胞病毒(HCMC)是导致胎儿中枢神经系统异常的一种感染性病原，王慧等[26]利用酵母双杂交发现鼠巨细胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122 蛋白与宿主因子Myst4相互作用的结合位点位于M122蛋白的1～148氨基酸，为预防和治疗MCMV导致的神经系统异常提供一定的理论基础。

4.4 建立蛋白质互作网络许多蛋白在功能上是互相联系的，在生命活动中彼此协调控制。随着基因组计划的完成，大量开放阅读框产生，研究阅读框的功能成为后续任务，这些基因的功能由其编码产生的蛋白质体现，利用酵母双杂交技术研究蛋白互作，并向大规模、自动化、高通量方向成熟[27]，建立起蛋白质互作网络。建立蛋白质互作网络能更加系统地了解生命活动，寻找有利蛋白，解决困扰人类的重大疾病[28]等。郜尽[29]在研究肝脏调控相关转录因子时选择32个ORF为诱饵筛选互作蛋白，绘制肝脏再生过程中转录因子互作网络，为肝脏蛋白质组学研究提供新思路。加拿大和美国科学家组成的一个国际研究小组，绘制出迄今最大规模的人类基因组编码蛋白间直接相互作用的图谱，并预测出数十个与癌症相关的新基因，包括蛋白质间 1.4 万个直接相互作用[30]。相信完成此项研究将会解释困扰人类的众多问题。

5 存在问题与展望

酵母双杂交系统自建立以来，虽存在假阳性、假阴性等局限性，但仍处于不断改进和完善的过程。因其快速、灵敏、高效的特征被广泛应用于蛋白质间的相互作用，蛋白质与基因的结构功能，新型多肽类药物的开发与利用等多个领域，并在此基础上衍生出酵母单杂交系统、反向酵母双杂交系统、酵母三杂交系统及Sos恢复系统等。为人类提供大量生物学信息，为人类获得生物体内蛋白质间作用关系的有效途径。随着科学研究的不断深入，相信酵母系统必将发挥越来越重要的作用。

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Review on Application Status of Yeast Two Hybrid System

CUI Hong-jun, WEI Yu-qing

(College of Bioscience and Bioengineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan, Ningxia 750021)

The yeast two hybrid system, as a kind of effective molecular biology method for studies of protein interactions, is real, effective, sensitive, and popular, which is widely used in proteomics, genomics and other fields. The principle, characteristics and application status of yeast two hybrid technology were reviewed.

Yeast two hybrid system; Protein-protein interaction; Application

北方民族大学国家级大学生创新创业训练计划项目(201311407019)。

崔红军(1990- )，女，河北河间人，本科生，专业：生物工程。

2015-03-24

S 188

A

0517-6611(2015)13-045-03