口蹄疫病毒样颗粒作为抗癌药物载体的条件探索

闫 丹，郭慧琛，冯 霞，靳 野，魏衍全，孙世琪(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疾病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州730046)

口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员，根据血清学类型可以分为7种血清型，分别为O型、A型、C型、亚洲1型(Asia 1)、南非1 型(SAT1)、南非 2 型(SAT2)和南非 3 型(SAT3)［1］。FMDV基因组由单股正链RNA组成，长度约为8 500 bp，病毒核酸被衣壳蛋白包被，形成二十面体结构，该二十面体衣壳是由口蹄疫病毒的4个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成。大量研究表明，口蹄疫病毒结构蛋白可以在体外环境中自组装形成不含病毒遗传物质的空衣壳，即病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)。病毒样颗粒作为纳米级生物材料，表现出良好的应用潜力，除了利用病毒样颗粒优越的免疫原性来研发新型疫苗外［2］，由于其生物相容性好，有较大的体表面积，运载量大，目前病毒样颗粒在异源抗原呈递、药物载体和运载外源小分子等方面也表现出独具的优势［3］。

抗癌药物阿霉素(DOX)在临床上被广泛应用于治疗，但由于其自身对细胞没有选择性，在应用中的缺点是毒副作用较大，这限制了其在临床上的应用，因此有必要对其进行相应修饰，改善其药物动力学效应，以期实现增效减毒的目的［4］。常用方法是在抗癌药物表面链接靶向分子(如抗体、受体配体等)，或者利用药物载体运载抗癌药物等［5－8］。笔者基于亚洲1型口蹄疫衣壳蛋白VP0、VP3、VP1在体外具有自组装能力，应用融合表达技术，原核表达可溶性口蹄疫病毒衣壳蛋白6×His-SUMO-VP0、6×His-SUMO-VP3和6×His-SUMO-VP1，切除衣壳蛋白肽链N端的6×His-SUMO标签蛋白使衣壳蛋白在特定组装体系中自组装成VLPs［9］，然后在其表面偶联抗癌药物，探索口蹄疫病毒样颗粒作为抗癌药物载体的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器 BIO-RAD DNA Engine(USA);BIO-RAD蛋白电泳仪(USA);核酸电泳仪和脱色摇床(北京六一仪器厂);振荡仪HZQ-Q(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、恒温培养箱和恒温水浴锅，均购自上海精宏;Gel-DOC XR凝胶成像仪(USA);台式常温离心机和各种规格微量移液器，均购自Eppendorf;超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物股份有限公司);贝克曼超速离心机(XPN-100/90/80);紫外吸收仪(B＆W TEK;USA);酶标仪(PerkinElmer Victor X4);共聚焦激光显微镜(Leica，USA)

1.2 试剂 蛋白纯化树脂(Ni-NTAsefinoseTMresin)亲和层析柱，购自上海生工生物工程股份有限公司。阿霉素、偶联试剂碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，均购自Sigma公司;咪唑和TritonX-100，均购自Amresco公司;其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。细胞培养液(DMEM)和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;试验用水均为超纯水(18.2 MΩ/cm)。

1.3 菌种、表达载体及抗体 含亚洲1型FMDV分离株VP1编码区的重组克隆质粒pSMA-VP1及带有SUMO和6×His融合标签的pSMK、pSMA表达载体与JM109大肠杆菌及BL21(DE3)-RIL表达菌株，均购自生工生物工程(上海)有限公司。兔抗亚洲1型单克隆抗体、FITC标记山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG抗体，均购自Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 FMDV衣壳蛋白VP0、VP3和VP1的表达纯化。将测序正确的阳性重组质粒pSMK-VP0VP3和pSMA-VP1共转化感受态细胞BL21(DE3)-RIL中，挑取单克隆菌落，接种于卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃下220 r/min过夜培养，然后将过夜培养的表达菌按1∶100的比例重新接种到新的含有上述抗性的LB培养基，于37℃，220 r/min的条件下培养至OD600为0.9左右，将菌液转入16℃条件下，加入1 mol/ml的 IPTG，使终浓度为 0.75 mmol/ml，诱导表达16 h后收集样品。按1∶50浓缩比例将菌体悬浮于 Buffer A(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L Imidazole，2 mmol/L DTT，0.05%TritonX-100，pH 8.4)中，充分混匀后在冰上超声波处理8 min，然后11 500 r/min 4℃下离心20 min收集上清，通过亲和层析镍柱纯化目的蛋白。然后，将纯化后的蛋白按照1∶100的体积加入SUMO酶，混匀后加入到截留分子量为8 kD的透析袋中，过夜透析，切除标签蛋白。

1.4.2 免疫印迹试验。将切除标签蛋白的样品进行12%SDS-PAGE电泳(80 V，2 h)，随后用半干转法将重组蛋白转移至聚偏氟乙烯杂交膜(PVDF膜)上(200 mA，3 h)，用5%脱脂奶粉(PBS，pH7.0)37℃条件下封闭1 h，TBST洗涤3次，然后分别用兔抗亚洲1型血清(1∶4 000)37℃孵育1 h，TBST充分洗涤后分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗体IgG(1∶6 000)37℃孵育1 h，TBST充分洗涤后于暗室加入ECL发光底物反应3 min，胶片曝光，显影及定影固定后观察目的蛋白表达情况。

1.4.3 FMDV-VLPs体外组装。将切除标签蛋白的样品装入截留分子量为8 kD的透析袋中，透析袋置于500 ml组装Buffer(250 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L Imidazole，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L DTT，0.1%TritonX-100，pH 8.4)中，4℃下轻微搅拌。24 h后收样，使用动态光散射仪(DLS)检测组装情况。

1.4.4 FMDV-VLPs体外偶联阿霉素。取1 ml组装好的体系，加入EDC和NHS溶液各40 μl(浓度均为1 mmol/ml)，反应30 min后将混合物加入到透析袋中，置于4℃冰箱内过夜透析，将未反应的分子去除。然后，将透析后的偶联物平铺到蔗糖密度梯度(15%、25%、35%、45%)离心管上，小心放到超高速低温离心机中，4℃下35 000 r/min离心2 h，然后将离心管中的液体每毫升收集1次，通过SDS-PAGE确定偶联物所在的位置。

1.4.5 细胞示踪试验。将A549细胞接种到有玻片的35 mm培养皿中，接种密度约为1×104个/ml，37℃培养箱培养24 h。加入口蹄疫病毒样颗粒和复合物后1 h和2 h分别处理细胞，接着用PBS洗涤3次，然后用4%的多聚甲醛室温下固定细胞15 min，再用PBS洗涤3次，用1‰ Triton X-100穿透15 min，用1∶2 000的猪源亚洲1型口蹄疫血清孵育1 h，PBS洗涤3次后，用FITC标记的山羊抗猪的二抗孵育1 h，PBS洗涤3次后用DAPI进行染核处理。15 min后用共聚焦显微镜观察。

2 结果与分析

2.1 口蹄疫结构蛋白纯化结果 将实验室保存的阳性重组质粒pSMK-VP0VP3和pSMA-VP1共转化E.coli表达菌BL21(DE3)codon plus-RIL中，发现融合蛋白His-SUMO-VP0、His-SUMO-VP3及His-SUMO-VP1在16℃条件下经IPTG诱导能成功表达，其分子量与理论值(45 kD、36 kD、35 kD)相近。分析发现，目的蛋白以可溶性融合蛋白的形式出现在菌体裂解液的上清中可溶性效果好，经亲和层析柱纯化融合蛋白(图1)，并且在低温条件下可溶性蛋白的表达量达到2.5 mg/ml。为了进行体外组装，用特异性SUMO酶对his-sumo标签进行酶切，利用SDS－PAGE和Western blot进行验证，如图2所示。

2.2 FMDV-VLPs体外组装结果 模拟病毒体外组装条件，将切除His-SUMO标签后的衣壳蛋白置于自组装Buffer中，轻微搅拌24 h 后，用0.22 μm 的滤器过滤，加入 60 μl样品到动态光散射仪的测量杯中，按照仪器的操作说明测量后得到粒径大小分布图。从图3可以看出，偶联阿霉素后的病毒样颗粒粒径大小有增大的趋势，这是因为阿霉素偶联在病毒样颗粒的表面，增加了病毒样颗粒的粒径，也说明了病毒样颗粒确实和阿霉素发生了偶联。剩下的病毒样颗粒用于后续偶联试验。

2.3 FMDV-VLPs病毒样颗粒偶联阿霉素 从图4可以看出，阿霉素在其含氧苯环侧链上带有一个伯胺基团，而病毒样颗粒表面有很多羧基，通过常用的化学偶联试剂碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，使伯胺和羧基形成腙键，从而将阿霉素偶联到病毒样颗粒的表面。在SDS-PAGE和核酸胶上，由于DOX自身有荧光，能在紫外光下被激发而表现出荧光，从而可以证明DOX是否与病毒样颗粒发生偶联。从图5可以看出，目的条带所在的位置有明显的荧光，而没有偶联的病毒样颗粒在相同的位置处，没有荧光。用非变性核酸胶电泳，由于病毒样颗粒携带了阿霉素，与未偶联的相比泳动速度变慢，从而跑在病毒样颗粒后面。

2.4 细胞示踪作用 通过不同的时间点(1、2 h)收集A549细胞样品，探讨偶联后的复合物是否能够特异性吸附癌细胞并且通过受体介导的作用进入细胞。已经有大量研究表明，在癌细胞表面，整合素受体与细胞的扩散增殖有关，所以会过量表达［10－12］，而口蹄疫病毒样颗粒在自组装的过程中保持了空间构型的完整，在VP1的loop结构中有抗原决定区，已经被证实该区域的RGD序列高度保守，能够利用整合素受体吸附细胞从而被内化进入细胞。从图6可以看出，在共聚焦显微镜照片中，单独的病毒样颗粒和偶联阿霉素的病毒样颗粒都能够随着时间的变化从细胞膜向细胞质内转移，说明病毒样颗粒偶联阿霉素后并没有影响其与整合素受体结合的能力。

3 讨论

探索新一代生物材料始终是纳米科技发展比较活跃的领域，其中VLP是自然存在的来自病毒蛋白的纳米级生物材料，在运载外源物质方面展示出极大应用潜力［13－15］。首先，病毒样颗粒可以在多种表达系统中得到有效表达，在原核系统中VLP的纯化比较简单，能够在体外高效表达和纯化，易于大规模生产纯化。其次，VLP作为一种纳米级材料，具有与其他纳米材料许多相同的特性，比如可以在其表面或者内部进行适当的化学或者基因修饰，能够容忍一定数量和大小的外源蛋白插入，这些特点赋予了它们可以通过分子生物技术手段而获得了更多的生物医学功能。再次，来自不同病毒的VLP在其外壳蛋白中一般会含有该病毒吸附侵入病毒时所用到的一些结合位点，可以靶向性结合宿主细胞，例如犬细小病毒样颗粒(CPV-VLP)对转铁蛋白受体有天然吸附趋势，因此可以通过和癌细胞表面过量表达的转铁素受体结合，就可能达到靶向性治疗癌症的作用。因此，VLP可以作为一种生物学应用的工具而成为一个良好的多功能平台，在药物运输、基因治疗、细胞靶向定位和治疗癌症等方面发挥作用。

笔者利用大肠杆菌融合表达亚洲1型口蹄疫病毒的结构蛋白VP1、VP2和VP3，并在体外组装缓冲液中形成和自然病毒形态机构十分相似的病毒样颗粒，运用一步偶联反应将抗癌药物偶联到口蹄疫病毒样颗粒表面，得到新型抗癌药物载体。通过SDS-PAGE和琼脂糖凝胶初步验证口蹄疫病毒样颗粒和抗癌药物发生了偶联，然后通过动态光散射仪测定了粒径大小，再次佐证了偶联反应确实发生。这说明口蹄疫病毒样颗粒可以作为一种纳米材料，对其表面进行适当的化学修饰，结果表明这些化学修饰没有破坏病毒样颗粒的完整性。

同时，还初步探讨了口蹄疫病毒样颗粒是否能够像自然病毒一样吸附入侵细胞，将偶联后的复合物和癌细胞共同孵育一段时间，然后借助共聚焦显微镜观察到病毒样颗粒复合物能够携带药物入侵到细胞质内，这为药物随后的治疗作用发挥提供了前提条件。该研究中获得病毒样颗粒表达系统为原核表达系统，该表达系统生产成本低，表达量高，这些条件为病毒样颗粒的其他生物应用提供了条件，使口蹄疫病毒样颗粒具有发展成为潜在的外源分子运载体的能力。虽然证实VLPs和药物可以形成复合物，但二者的最佳结合率还需要进一步摸索，新形成的复合物在不同条件下的的稳定性还需要进一步探索，新形成的复合物的抗癌效果还可能需要体外或者体内试验进行验证，这些初步探索为病毒样颗粒发挥更多的生物学应用提供了借鉴。

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