广东紫珠中齐墩果酸和熊果酸含量的比较研究

吴方评，蒲艳春(湖南医药学院，湖南怀化418000)

广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun)为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(Callicarpa L.)植物，别名万年青、珍珠风、臭常山、老鸦饭、金刀菜等，生于海拔300～1 600 m的山坡灌木丛或山地，主要分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、贵州、云南等地，收载于2010版中国药典［1］。广东紫珠地上部分均可入药，其性味苦、涩、凉，具有收敛止血、清热解毒和散瘀的作用，用于湿热黄疸、胁痛不适等症。经研究发现，紫珠中含有黄酮、酚酸、三萜和苯丙素等类别化合物［2－5］，总黄酮部位是其抗宫颈炎有效部位［6］，三萜部位主要含齐墩果酸和熊果酸等成分［7－8］，有良好的护肝作用和对肝脏的抗脂质过氧化(LPO)作用［9－10］，目前，广东紫珠护肝产品市场鲜有报道。该试验采用高效液相色谱法首次对不同产地、不同部位和不同采收期广东紫珠中齐墩果酸和熊果酸的含量进行同时测定，为广东紫珠种植时地理条件、采收部位和适宜采收时间的选择提供指导，也为广东紫珠资源的合理开发和综合评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。10个批次的广东紫珠主要采摘于湖南和江西2个产区，经湖南医药学院中药现代化研究中心汪冶教授鉴定为马鞭草科植物紫珠。

1.1.2 主要仪器。Agilent1260高效液相色谱仪，G1311B四元泵(带在线脱气机)，G4212B DAD阵列二极管检测器，Agilent汉化版色谱工作站，迪马 Diamonil C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱;电子分析天平(岛津 AUW120D);超声波中药处理机(LC－350A)。

1.1.3 主要试剂。齐墩果酸对照品(批号110709－201206，供含量测定用)和熊果酸对照品(批号110742－201220，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定研究院提供;甲醇和乙腈为色谱纯(天津赛福瑞科技有限公司);水为重蒸水;其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 色谱分析条件。色谱柱为迪马Diamonil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈 － 水(95∶5)，流速 0.5 ml/min，进样量 10 μl，检测波长210 nm。

1.2.2 对照品溶液的制备。分别精确称取齐墩果酸4.0 mg、熊果酸4.6 mg于10 ml容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，即得0.40 mg/ml齐墩果酸储备液和0.46 mg/ml熊果酸储备液。

1.2.3 供试品溶液的制备。分别称取样品粉末(过40目筛)0.1 g于10 ml容量瓶中，加入甲醇约8 ml，放入超声波中药处理机中处理45 min，取出，放置室温，用甲醇定容至刻度，进样前用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，按“1.2.1”色谱条件进样。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 系统适应性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μl，在“1.2.1”色谱条件下，进样测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2 线性关系的考察。分别精密量取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml的齐墩果酸和熊果酸于 10 ml容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得 4.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 μg/ml齐墩果酸系列浓度校正液和 4.6、23.0、46.0、69.0、92.0、115.0、138.0 μg/ml熊果酸系列浓度校正液，按照“1.2.1”色谱条件进样，以浓度 X(μg/ml)为横坐标、面积响应值Y为纵坐标，分别计算齐墩果酸和熊果酸线性回归方程。

1.2.4.3 检测限和定量限的考察。将齐墩果酸和熊果酸对照品溶液逐步稀释后进样测定，以色谱图中信噪比(S/N)为3时的进样量为最低检测限(LOD)，信噪比(S/N)为10时的进样量为最低定量限(LOQ)。

1.2.4.4 稳定性试验。取同一供试样品溶液，按“1.2.1”色谱分析条件分别于 0、1、2、4、8、16、24 h 进样，进样量 10 μl，测定峰面积积分值，计算RSD。

1.2.4.5 精密度试验。取按“1.2.3”方法制备的供试品溶液重复进样7次，计算峰面积的RSD值。

1.2.4.6 重复性试验。精密称取0.1 g同一批次的广东紫珠样品7 份，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件分析，测定峰面积，计算平均含量和RSD。

1.2.4.7 加样回收试验。精密称取同批次已知含量(齐墩果酸0.241 4 mg/g，熊果酸0.694 4 mg/g)的广东紫珠6份，分别置于10 ml容量瓶中，并加入齐墩果酸和熊果酸，按照“1.2.3”处理、“1.2.1”色谱条件进样分析，测定齐墩果酸和熊果酸的含量，计算回收率。

1.2.5 样品的含量测定。精确称取不同产地广东紫珠药材10批、不同采收期样品5批，每批药材取5个平行样，按照“1.2.3”进行样品处理、“1.2.1”色谱条件进样分析，用外标法分别对齐墩果酸和熊果酸进行含量测定。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适应性试验。图1表明，在“1.2.4.1”条件下，样品色谱图中齐墩果酸和熊果酸的保留时间分别为16.378和16.932 min，色谱柱的理论塔板数大于6 000，分离度约为1.5，齐墩果酸和熊果酸基线基本能够分离，峰形对称，表明此色谱条件可用于齐墩果酸和熊果酸的同时分析。

2.1.2 线性关系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以进样浓度X(μg/ml)为横坐标、峰面积Y为纵坐标计算得出齐墩果酸和熊果酸线性回归方程分别为Y=5.070 5X－2.268 4(R2=0.999 7)、Y=4.081 4X+1.066 2(R2=0.999 3)，表明齐墩果酸和熊果酸分别在0.040 0 ～1.200 0、0.046 0 ～1.380 0 μg范围内线性良好。

2.1.3 检测限和定量限的考察。按“1.2.4.3”方法操作，结果表明，齐墩果酸和熊果酸的检测限分别为0.001 6和0.002 1 μg，定量限分别为 0.005 4 和 0.005 8 μg。

2.1.4 稳定性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算得出齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD分别为1.73%和1.95%，表明样品溶液24 h内稳定性良好。

2.1.5 精密度试验。按“1.2.4.5”方法操作，齐墩果酸和熊果酸对照品峰面积的RSD分别为0.94%和1.13%，表明在此试验条件下精密度良好。

2.1.6 重复性试验。按“1.2.4.6”方法操作，测得齐墩果酸和熊果酸含量分别为 0.241 4、0.694 4 mg/g，RSD 分别为1.95%和2.31%(n=7)，表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收试验。由表1～2可见，齐墩果酸、熊果酸的平均回收率分别为98.90%、98.75%，RSD分别为0.64%、0.55%，表明该方法准确、可靠，可用于广东紫珠中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。

表1 广东紫珠中齐墩果酸的精密度和回收率试验

2.2 含量测定 从表3～4可以看出，不同产地广东紫珠样品中齐墩果酸和熊果酸含量以江西萍乡种植果实为最高，分别达0.469 9和1.404 8 mg/g，江西萍乡收割后幼苗中齐墩果酸和熊果酸的含量也较高，分别达0.379 4和1.041 4 mg/g;不同采收期广东紫珠样品中齐墩果酸和熊果酸的含量以11月初为最高。

表2 广东紫珠中熊果酸的精密度和加样回收率试验

表3 不同产地广东紫珠样品中齐墩果酸和熊果酸的含量

表4 不同采收期广东紫珠样品中齐墩果酸和熊果酸的含量

3 结论与讨论

3.1 药材质量控制标志物选择的考量 广东紫珠为2010版药典收藏药材，以连翘酯苷B和金石蚕苷为标识物来评价广东紫珠的质量，如开发出相关的护肝产品，该方法选用齐墩果酸和熊果酸作为对该产品质量控制的标识物有一定的意义。

3.2 流动相的选择 试验过程中试用了不同的流动相，结果发现流动相为乙腈∶水=95∶5时峰形对称，出峰时间适宜，杂质峰对被检测峰干扰小。因此，试验采用乙腈∶水=95∶5作为流动相。

3.3 提取方法和提取溶剂的优选 该试验采用乙醇、95%乙醇、50%乙醇、甲醇和50%甲醇作为超声提取溶剂，结果表明，用乙醇作为提取溶剂在检测时会出现较大溶剂峰，用50%甲醇作为提取溶剂提取耗时过长。该试验采用甲醇作为提取溶剂，超声提取45 min，待测物基本能提取完全。

3.4 药材采收方式的选择 从不同产地样品的分析结果发现，江西萍乡种植的广东紫珠中齐墩果酸和熊果酸的含量较高;采收后第2年新长成的幼苗与头年采收的果实样品相比，齐墩果酸和熊果酸的含量普遍偏高;从不同采收期样品分析结果发现，11月初采收的广东紫珠齐墩果酸和熊果酸的含量较高。以上分析结果对广东紫珠药材的种植环境、采收时间等的选择有一定的指导作用，对广东紫珠药材资源的开发和合理利用也有一定的意义。

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