明绿豆苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质初步研究

张 瑜 李梅青，2 代蕾莉 蔡 娟 付志伟

（安徽农业大学茶与食品科技学院1，合肥 230036）

（合肥农产品加工研究院2，合肥 230036）

明绿豆苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质初步研究

张 瑜1李梅青1，2代蕾莉1蔡 娟1付志伟1

（安徽农业大学茶与食品科技学院1，合肥 230036）

（合肥农产品加工研究院2，合肥 230036）

为了研究明绿豆中苯丙氨酸解氨酶（PAL）的动力学特性，采用35%和65%饱和度的硫酸铵分级沉淀、DE－52阴离子交换层析方法对明绿豆中的PAL进行了分离纯化，并对其基本性质做了初步研究。结果表明，PAL的纯化倍数为6.982 9，蛋白质得率为4.65%，酶得率为32.45%。PAL在硼砂－硼酸缓冲溶液中适宜的pH范围为7.6～9.0，最适pH有2个：8.0和8.6。PAL适宜的温度范围为35～45℃，最适反应温度为40℃。得到 PAL的 2个 Km值，分别是：Km1为6.94×10－5mol／L，Km2为 1.23×10－4mol／L。本研究结果可为进一步研究和开发明绿豆的PAL提供参考。

明绿豆 苯丙氨酸解氨酶 分离纯化 基本性质

绿豆（Mung bean）为豆科草本植物绿豆（Phaseolus radiatus）的成熟种子［1］。《本草纲目》中提及：“绿豆，消肿治痘之功虽同于赤豆，而压热解毒之力过之”，并可“解金石、砒霜、草木一切诸毒”。可见古人认识到绿豆具有清热解暑、止渴利尿、消肿止痒、解毒等药用功效［2－3］。

苯丙氨酸解氨酶（L－phenylalanine ammonialyase，PAL；EC4.3.1.5）能催化L－苯丙氨酸生成反式肉桂酸进入苯丙烷代谢途径，为多种酚类、生物碱及类黄酮等终产物提供前体物质，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶和限制酶［4－5］。Abell等［6］依据 PAL特异的催化反应将其用于抗肿瘤和治疗苯丙酮尿症的研究中，并取得了肯定的结果。PAL主要存在于高等植物（如：银杏叶［7］、山药［8］、石斛［9］、绿豆［10］等）、部分微生物（丝状真菌、酵母及链霉菌）和某些藻类中。国内有研究证明，从绿豆中提取的PAL对小鼠淋巴白细胞白血病细胞株（L1210）的抑制作用随作用时间的延长和药物剂量的增加而增强［10］。然而，绿豆中PAL纯化及基本性质的研究鲜见报道。

明光绿豆以其色泽晶莹碧绿，粒大皮薄、汤清易烂，清香可口等特点，质量为全国之冠，被称为“明绿”，曾经被作为贡品。2008年，“明光绿豆”获得国家原产地保护标志，然而，对其功能性成分分析研究极少。

本研究采用盐析方法分离明绿豆中的PAL，采用离子层析法对其进一步纯化，并对其性质进行初步研究，系统了解明绿豆PAL的反应动力学特性，为明绿豆功能性成分的高效利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明绿豆：安徽燕之坊食品有限公司；β－巯基乙醇、EDTA、L－苯丙氨酸、牛血清蛋白均为分析纯。高速冷冻离心机（LR16－A）：北京雷勃尔离心机有限公司；DE－52：Whatman分装。

1.2 试验方法

1.2.1 酶活性及蛋白质的测定

1.2.1.1 酶活性测定及活性单位的定义

采用Koukol等［11］的方法，略加修改。吸取0.5mL 0.06mol／L的L－苯丙氨酸和9.45mL硼酸－硼砂缓冲溶液（pH 8.7，20 mmol／Lβ－巯基乙醇，1 mmol／L的EDTA），加入0.05mL的酶液。同时调零管取0.5mL 0.06mol／L的L－苯丙氨酸，加9.5mL的硼酸－硼砂缓冲溶液；对照管加入9.95mL的硼酸－硼砂缓冲溶液和0.05mL的酶液。40℃水浴反应1 h，滴加6mol／L的 HCl 0.2mL终止反应，于290 nm处比色。以每小时每毫升酶液光密度值增加0.01为一个酶活单位（U）。所有测定均重复3次。

1.2.1.2 蛋白质含量的测定

参照Bradford等［12］方法以牛血清蛋白做标准曲线得到回归方程：y＝0．492 8x＋0．026 5。

1.2.2 明绿豆PAL粗酶液的制备及分离纯化

1.2.2.1 PAL粗酶液的提取

取明绿豆80 g，加入预冷的硼酸－硼砂缓冲溶液160mL，于4℃的冰箱浸泡24 h。捣碎，匀浆，4℃下12 000 r／min离心20min，上清液即为粗酶液，取粗酶液4℃下保存以供纯化。

1.2.2.2 硫酸铵分级沉淀及脱盐浓缩

将固体硫酸铵粉末加入粗酶液至35%饱和度，磁力搅拌30min，4℃静置4 h。4℃下12 000 r／min离心20min，取上清液加固体硫酸铵粉末到65%饱和度，然后依据上述方法，4℃下12 000 r／min离心20min，弃上清液。将沉淀复溶于70mL 0.05mol／L的Tris－HCl（pH＝8.8）缓冲溶液中。将复溶后的酶液装入已经处理好的透析袋中，4℃下用0.05mol／L的Tris－HCl缓冲溶液中脱盐10 h，然后再用聚乙二醇浓缩1 h。

1.2.2.3 PAL粗酶液的纯化

将浓缩后的酶液过DE－52层析柱（Φ2.6 cm×30 cm，已用 pH为8.8的0.05mol／L Tris－HCl缓冲溶液平衡），以0～0.8mol／L的 NaCl Tris－HCl（pH 8.8）缓冲溶液梯度洗脱，每5min 1管，每管10mL。合并有酶活的部分，然后经透析、超滤浓缩、冷冻干燥得纯酶。

1.2.3 PAL酶学性质

1.2.3.1 明绿豆PAL最适pH、温度、酶浓度、底物浓度的测定

根据酶活性测定的反应体系，以0.06mol／L的L－苯丙氨酸为底物，在pH值为7.6～9.2的硼酸－硼砂缓冲溶液反应体系中设定一系列pH梯度，测定各梯度pH的酶活力，确定PAL的最适pH；在25～80℃温度范围内，设置一系列的温度梯度，测定各温度梯度下PAL的酶活力，确定最适反应温度；分别取PAL酶液0.1～1.7mL，设置一定酶浓度梯度的反应体系，并测定各酶浓度梯度下PAL的酶活，确定最适酶浓度。在L－苯丙氨酸的终物质的量浓度为0.5～9 mmol／L内，设置一系列底物浓度的反应体系，并测定各体系中PAL的活力，确定最适底物浓度。

1.2.3.2 明绿豆PAL动力学曲线

取0.05mL的酶液和0.5mL的0.06mol／L的L－苯丙氨酸溶液，加pH 8.7硼酸－硼砂缓冲溶液定容至10mL，于40℃水浴。5～360min内设置一系列的时间梯度，并测定各时间梯度PAL的酶活力。

1.2.3.3 明绿豆PAL的Km值

在9.45mL pH 8.7硼酸－硼砂缓冲溶液中加入0.05mL酶液，再分别加入0.5mL物质的量浓度0.001～0.01mol／L的L－苯丙氨酸溶液，测定各浓度对应的PAL酶活力。将各底物浓度的酶活力对反应时间作图，求出酶促反应速度V。分别求出1／［V］及1／［S］，按照 Lineweaver－Burk双倒数法作图，求出PAL的Km值。

2 结果与分析

2.1 明绿豆PAL的分离纯化

明绿豆PAL粗酶液经硫酸铵分级沉淀、脱盐浓缩以及DE－52层析，分离纯化结果见表1，洗脱结果见图1。

表1 明绿豆PAL的分离纯化结果

图1 明绿豆PAL纤维素DE－52层析结果

由表1可知，明绿豆PAL的纯化倍数为6.982 9，蛋白质得率为4.65%，酶得率为32.45%。由图1可知有2个活力峰，从而推测PAL有2种同工酶。

2.2 明绿豆PAL最适pH、温度、酶浓度、底物浓度

由图2可以看出，在不同pH的硼酸－硼砂缓冲溶液中酶活力出现2个峰值，即2个最适pH值：8.0和8.6，这可能与明绿豆体内含有PAL的同工酶有关［13］。明绿豆PAL在 pH 7.6～9.0时酶活力都在其最大活力的50%以上，因此该酶在pH 7.6～9.0之间比较稳定。PAL维持活性的最适pH范围为8.0～9.5。

图2 酶的最适pH

由图3可知，明绿豆PAL在25～40℃时，酶活性随着温度的升高而上升。当温度处于35～40℃范围时，酶活力较高，为最适温度范围，40℃时明绿豆PAL活力最高，45℃以后酶活性受到抑制。当温度接近80℃时PAL的活力已基本丧失。此结果与其他材料中的PAL研究结果基本一致［14－18］。

图3 酶的最适温度

如图4所示，明绿豆PAL的最适底物物质的量浓度为1.5 mmol／L，此时酶活力达到最大值，而当底物物质的量浓度达到5 mmol／L时，酶活性到达第二个峰值。然后随底物浓度的增大，酶活力减少。当底物物质的量浓度增大到7 mmol／L时，酶活力逐渐保持稳定。

图4 底物浓度对酶活力的影响

由图5可知，在酶量较低，即酶量小于0.13mL时，随着酶量的增加，其吸光值增加较明显。当加酶量高于0.13mL时，吸光值的增加缓慢。这可能是因为此时底物相对于酶是过量的，而高浓度的底物会抑制底物，增加酶的浓度能解除这种抑制，从而增加酶的含量，提高酶的反应速率。当酶浓度较高而底物浓度不足时将产生限制因子，反应速度与酶浓度之间不再保持线性关系，或者是酶作用产物的增加对酶产生抑制作用，从而导致反应速度增长量的下降［9］。

图5 酶量对酶活力的影响

2.3 明绿豆PAL的动力学曲线

PAL催化L－苯丙氨酸反应生成反式肉桂酸，在反应开始的3 h内，反应产物与反应时间基本成线性关系（图6），但是反应在80min内的速率比80～180min内的反应速率高。PAL在反应3 h之后，反应进程曲线逐渐变平。这是因为苯丙氨酸逐渐减少，反式肉桂酸的生成量逐渐积累，对酶的反馈抑制作用加强，所以反应速度逐渐下降［8］。

图6 PAL的反应进程曲线

2.4 明绿豆PAL的Km

用Lineweaver－Burk双倒数法作图，结果如图7所示。Km即为直线在X负轴上截距的负倒数。由图7可知明绿豆PAL有2个Km值，通过计算可得：Km1为 6.94×10－5mol／L，Km2为 1.23×10－4mol／L，这与0.3×10－4～1.5×10－2mol／L之间的结果相一致［5］。

图7 PAL双倒数作图

3 讨论

试验结果的蛋白质得率偏低，这或许与本试验在进行粗酶分离时所采用的硫酸铵的饱和度、离子强度以及缓冲溶液的pH没有经过优化有关。离子洗脱时PAL得率偏低，主要是因为PAL存在同工酶［13］，经硫酸铵分级沉淀及DE－52柱后去除了部分同工酶，纯化出单一酶的过程可能造成部分损失所致。

对PAL性质的前期研究发现：银杏叶中PAL的2个最适pH 8.0和8.8［19］、山药中PAL的2个最适pH 8.0和 8.8［8］、霍山石斛中 PAL的最适 pH 8.4［9］，无壳葫芦籽中的最适pH 8.5［14］，这表明不同植物来源的PAL的最适pH存在差异。

本研究中底物浓度对PAL活力的影响曲线图呈S型，这与其他原材料 PAL研究结果类似，如银杏［19］、石斛［9］、山药［8］及芦笋［20］等，这可能与不同来源PAL普遍存在同工酶有关。同时有报道称，如果PAL存在别构酶，也会导致这种情况的出现［21］。对此，还需进一步研究。

4 结论

明绿豆PAL的纯化倍数为6.982 9，蛋白质得率为4.65%，酶得率为32.45%。PAL适宜的pH范围为7.6～9.0，最适pH值分别为8.0和8.6。适宜的温度范围为35～45℃，最适反应温度为40℃，45℃以后酶活性受到抑制。当温度接近80℃时PAL的活力已基本丧失。

明绿豆PAL的最适底物物质的量浓度为1.5 mmol／L。当底物物质的量浓度增大到7 mmol／L时，酶活力逐渐保持稳定。

明绿豆PAL催化L－苯丙氨酸反应生成反式肉桂酸，在反应的开始3 h内，反应产物与反应时间基本成线性关系。反应3 h之后，反应进程曲线逐渐变平。所以在测定PAL的活性时，反应时间选择3 h之内为基准，以1 h的反应产物量表示酶的活力。

Lineweaver－Burk双倒数法作图，得到明绿豆PAL的2个 Km值，分别是：Km1为6.94×10－5mol／L，Km2为 1.23×10－4mol／L。

［1］江苏新医学院.中药大词典［M］.上海：上海科技出版社，1986：2272

［2］赵守训，黄泰康，丁志尊.中药辞海［M］.第三卷.北京：中国医药科技出版，1997：642－643

［3］佘纲哲，张恒.绿豆的营养成分及利用［J］.生物学通报，1991（7）：18－19

［4］江昌俊，余有本.苯丙氨酸解氨酶的研究进展［J］.安徽农业大学学报：自然科学版，2001（4）：425－430

［5］MacDonald M Jason，Godwin BD'Cunha.A modern view of phenylalanine ammonia lyase［J］.Biochemistry and Cell Biology，2007，85（3）：273－282

［6］Abell CW.The effects of PAL on leukemic lymphocytes in vitro［J］.Cancer Research，1972，32：215－290

［7］刘卫红，王燕，杜何为，等.银杏叶苯丙氨酸解氨酶分离纯化条件的研究［J］.湖北农学院学报，2004，24（3）：196－198

［8］江力，袁怀波，张世杰，等.山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究［J］.食品科学，2006，27（10）：36－40

［9］张宽朝，金青，谈俊，等.霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及基本性质研究［J］.食品工业科技，2009，30（8）：133－136

［10］唐煦，周国林.绿豆苯丙氨酸解氨酶的性质及抗肿瘤作用研究［J］.微生物学免疫学进展，1996，24（1）：35－39

［11］Koukol J，Conn E E.The metabolism of aromatic compounds in higher plants.Ⅳ.Purification and properties of the phenylalanine deaminase of Hordeum vulagare［J］.Journal of Biology and Chemistry，1961，236：2692－2698

［12］Bradford Marion M.A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248－254

［13］Jorrin J，Dixon R A.Stress responses in alfalfa II.Purification，characterization and induction of phenylalanine ammonia lyase isoforms from elicitor－treated cell suspension cultures［J］.Plant Physiology，1990，92：447－455

［14］孟延发.无壳葫芦籽苯丙氨酸解氨酶的纯化及其基本性质［J］.兰州大学学报：自然科学版，1991，27（2）：134－139

［15］Given N L.Purification and properties of phenylalanine ammonia－lyase from straw berry fruit and its synthesis during ripening［J］.Journal of Plant Physiology，1988，133（1）：31－37

［16］H W Lim，SSPark，C JLim.Purification and properties of phenylalanine ammonia－lyase from leafmustard［J］.Canadian Metallurgical Quarterly，1997，7（6）：715－720

［17］Havir EA.Phenylalanine ammonia－lyase：purification and characterization from soybean cell suspension cultures［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1981，211（2）：556－563

［18］刘鸿年，刘发敏.茶鲜叶苯丙氨酸解氨酶的提取及其活性测定［J］.中国茶叶，1989（1）：4－5

［19］王燕，刘卫红，杜何为，等.银杏叶中苯丙氨酸解氨酶基本特性的研究［J］.湖北农业科学，2004（5）：72－74

［20］李艳华，王庆国.芦笋过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶特性及抑制条件的研究［J］.食品与发酵工业，2007，33（11）：55－59

［21］程水源，陈昆松，刘卫红，等.植物苯丙氨酸解氨酶基因的表达调控与研究展望［J］.果树学报，2003，20（5）：351－357.

Purification and Properties of Phenylalanine Ammonia－Lyase in Ming Mung Bean

Zhang Yu1Li Meiqing1，2Dai Leili1Cai Juan1Fu Zhiwei1

（Anhui Agricultural University School of Tea and Food Science＆Technology1，Hefei 230036）
（Institute of Hefei Agricultural Products Processing2，Hefei 230036）

The study in this paper aimed to research the dynamics characteristics of phenylalanine ammonialyase（PAL）from Mingmung bean.The isolation，purification and basic properties of L－phenylalanine ammonialyase in Mingmung bean were studied by 35%and 65%saturation of ammonium sulfate grade deposition，DE－52 anion exchange chromatography.The results showed that the purification multiple was 6.982 9 and protein yield and PAL yield were 4.65%and 32.45%respectively.The optimal pH range of PAL in borax－boric acid buffer was 7.6～9.0 and there were two optimal pH as 8.0 and 8.6.The optimal temperature range of PAL was 35～45℃.The optimal temperaturewas40℃.Therewere two Kmvalues including 6.94×10－5mol／L and 1.23×10－4mol／L.The results provided the reference for further studying and developing PAL of Mingmung bean.

mingmung bean，L－phenylalanine ammonia－lyase，isolation and purification，basic properties

Q946.5

A

1003－0174（2015）06－0101－05

合肥农产品加工研究院资助院企合作项目（2012HAP P002）

2014－01－22

张瑜，女，1988年出生，硕士，植物源食品开发与利用

李梅青，女，1965年出生，副教授，农产品加工与贮藏