实时荧光定量PCR法检测蜡样芽孢杆菌

崔溢，张贵海

（石家庄博维生物科技有限公司，石家庄050071）

0 引言

蜡样芽孢杆菌分布广泛，常见于土壤、灰尘和污水中，在植物性食品和许多生熟食品中也常见；是一种好氧性、在厌氧情况下也可很好生长的革兰氏阳性杆菌。蜡样芽孢杆菌大小为(1～1.3 μm)×(3～5 μm)能够形成芽孢，菌体两端较平整，多数呈链状排列；其芽孢呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端[1]。

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入可被检测到的荧光基团，利用DNA复制时荧光信号的积累实时监控DNA扩增情况，最后通过标准曲线对未知模板进行分析的方法[2]。该技术目前已广泛应用到各个领域当中，比如婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌和肠杆菌科的检测[3]。

本研究使用全新的实时荧光定量PCR方法对蜡样芽孢杆菌（DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778）分别从包含性、不包含性、检出限、稳定性等方面进行检测。并对新方法进行了充分讨论。

1 材料和方法

1.1 材料

蜡样芽孢杆菌菌株：DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778。

其他菌株：产气荚膜梭菌DSM 11784，嗜肺军团菌ATCC 33153，鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311，大肠杆菌ATCC 8739。

所需耗材： 离心管（1.5ml），枪头，微孔板。

所需试剂：蜡样芽孢杆菌专用DNA提取试剂，蜡样芽孢杆菌检测试剂盒。

1.2 仪器

生物安全柜-2A级，PCR工作站（UV柜），荧光定量PCR仪，微型离心机，小型高速离心机，冰箱，天平，pH检测仪，涡旋震荡器，金属浴锅，微量移液器，离心管架，移液管等。

1.3 检测方法

DNA的提取：将样品离心，去除上清液，加入蜡样芽孢杆菌专用DNA提取试剂，充分混匀后95℃培养5 min，之后13 000 g离心2 min，上清液即含有蜡样芽孢杆菌的DNA可直接用于PCR。

PCR的建立：使用蜡样芽孢杆菌检测试剂盒进行PCR的建立。每个PCR反应中分别加入引物/探针混合液4 μL，2xPCR Master mix 10 μL，PCR级水1 μL，样品DNA5 μL。总共20 μL体系。

PCR的运行:将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行检测。PCR程序为预变性：95℃10 min；扩增：95 ℃ 10 min，60 ℃ 1 min，40个循环。同时收集FAM和VIC/HEX通道信号。并按照表1读取结果。

表1 结果判读

2 结果和分析

2.1 特异性（包含性与不包含性）

2.1.1 包含性

分别对蜡样芽孢杆菌DSM 4282、DSM 4284的DNA稀释了10倍、100倍，对ATCC 11778的DNA稀释了10倍、100倍、1000倍进行了包含性的测试，结果如表2所示。

表2 包含性实验结果

由表2可以看出，在不同的稀释倍数下，检测的不同蜡样芽孢杆菌菌株均有Ct值，测试结果均为阳性，没有假阴性的现象产生。

2.1.2 不包含性

在不包含性实验中，我们对非蜡样芽孢杆菌的DNA进行了测试，分别是产气荚膜梭菌DSM 11784，嗜肺军团菌ATCC 33153，鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311，大肠杆菌ATCC 8739，结果如表3所示。

由表3可以看出，在所测试的4种非蜡样芽孢杆菌的菌株中FAM通道均没有Ct值，而VIC/HEX通道均有Ct值。说明PCR顺利进行，所得结果均为真阴性结果，没有假阳性现象产生。

2.2 灵敏度（检出限）

为了检测实时荧光定量PCR方法的灵敏度，将提取的蜡样芽孢杆菌DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778的DNA（初始质量浓度为50 pg/μL）进行逐级稀释。表4为将初始DNA逐级稀释到107倍时每个反应所分别对应的DNA含量和基因组当量。表5为检测结果。

通过实验发现将蜡样芽孢杆菌DSM 4282，DSM 4284和ATCC 11778的DNA稀释到1 000倍时均有Ct值，此时对应的浓度为0.25 pg。而将DNA稀释到10 000倍时只有蜡样芽孢杆菌ATCC 11778有Ct值。由于每个反应里含有5 μL的DNA，故该方法的检出限为0.005-0.05 pg/μL。

表4 不同稀释倍数下对应的基因组当量

2.3 稳定性

我们随机选取了6个样品进行了重复性实验，分别是10倍稀释的蜡样芽孢杆菌DSM 4282，100倍稀释的蜡样芽孢杆菌DSM 4282，10倍稀释的蜡样芽孢杆菌DSM 4284,100倍稀释的蜡样芽孢杆菌DSM 4284,1 000倍稀释的蜡样芽孢杆菌ATCC 11778和产气荚膜梭菌DSM 11784。实验结果如表6所示。

通过重复性实验我们发现蜡样芽孢杆菌的两次检测结果Ct值基本相同，而产气荚膜梭菌DSM 11784的两次测试结果均为阴性。说明该方法的稳定性良好。

3 结果与讨论

加强对食品中蜡样芽胞杆菌的检测非常必要，尤其是在对食品安全需求越来越高的今天[4]。与传统的微生物学检测方法相比[5]，实时荧光定量PCR技术的出现提供了一个全新的检测思路。实时荧光定量PCR技术有着特异性强，灵敏度高，重复性好等优点。

在包含性实验中，实时荧光定量PCR法对所有的蜡样芽胞杆菌不同菌株均能检测出来；在不包含性实验中，实时荧光定量PCR法对所有的非蜡样芽胞杆菌的菌株均显示为阴性；在灵敏度实验中，实时荧光定量PCR法显示出了较高的灵敏度（0.05 pg/μL）；在稳定性实验中，实时荧光定量PCR法显示出良好的稳定性。

总而言之使用实时荧光定量PCR的方法检测样品中的蜡样芽胞杆菌特异性强，灵敏度高，重复性好，有着良好的应用前景。

表5 检出限测试结果

表6 稳定性实验结果

[1]张伟伟，鲁绯，张金兰，等.食品中蜡样芽孢杆菌的研究进展[J].中国酿造，2010（5）：1-4.

[2]黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用[M].化学化工出版社,2011:52-53.

[3]崔溢，张贵海.实时荧光定量PCR法检测阪崎肠杆菌和肠杆菌科[J].中国乳品工业，2014（9）：41-43.

[4]SCHOENI JL,WONG AC.Bacillus cereus food poisoning and its toxins[J].Journaloffood protection.2005(3):636-648.

[5]中华人民共和国国家标准:GB/T26427—2010饲料中蜡样芽孢杆菌的检测[S].