饲料中不同水平重金属铬对牛乳中铬的影响

田成新，李然，李琳瑶，满朝新，李婷，刘少敏，娄彬彬，姜毓君

（东北农业大学a.食品学院乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030）

0 引言

随着人口的快速增长、城市化及工业化进程的发展，环境污染日益严重，且大多数工业废物含有大量的重金属污染物[1,2]，其中重金属铬可以污染土壤和水源，进而在植物中蓄积，最终经食物链危害人体健康[3]。有研究表明，铬（特别是六价铬）可以对人体的呼吸道、胃肠道、皮肤等造成损伤[4]。乳及乳制品是人类膳食中的重要组成部分，有毒重金属污染的牛奶可能严重危害人类的健康[5]。铬是乳中重要监控的污染物之一，中国国家标准中规定，生鲜乳中铬的限量值为0.3 mg/kg[6]。因此，研究奶牛外源摄入铬对泌乳中铬的含量影响，对保证原料乳的安全有重要意义。本研究以烟酸铬形式饲喂奶牛不同剂量的铬，检测原料乳中重金属铬含量，研究饲料中不同水平的铬对奶牛泌乳中铬含量的影响。

1 实验

1.1 材料

试验动物：本实验选取15头体况、泌乳期段及产奶量基本相同的荷斯坦奶牛。所选奶牛日产奶量约30 kg，年龄约为2～5岁，体质量约为600 kg，饲养管理标准相同，健康状况良好。

主要试剂：烟酸铬（饲料级≥99.5%）；国家标准溶液（铬Cr质量浓度1 000 μg/mL，介质10%HNO3）；硝酸（高纯试剂MOS）；高氯酸（高纯试剂MOS）；纯牛奶（全脂乳）。

主要仪器：原子吸收光谱仪（PinAAcle 900H），电热消解仪（EHD 36），超纯水制造系统（MILLI-Q），数控超声波清洗器（KQ-500DE），电子天平（0.001g），50 mL带刻度玻璃消解管（GC-36-L）。

1.4 方法

1.4.1 奶牛的饲喂与管理

本研究选取了某牧场的15头奶牛，试验所处季节为秋季（9～11月份）。从所选的15头牛随机平均分为3组，分别定义为低剂量组、中剂量组和高剂量组。15头试验牛与大群分栏隔离喂养，统一榨乳。奶牛通过自锁式颈夹进行自由采食，通过不锈钢保温自动饮水槽自由饮水。采用由牧场奶牛营养部门提供的泌乳期高产牛日粮进行饲喂。

1.4.2 给药

本试验的奶牛给药方式采用经口给药方式，以烟酸铬的形式给奶牛灌喂不同剂量水平的铬，剂量设计如表1所示。给药时间为每天16:00～17:00之间，烟酸铬连续给药40 d后停药。

表1 剂量组设计 g/d

重金属铬的中剂量选择，综合了奶牛日摄入青贮、精料、饲料、豆粕、水等投入品可能接触铬的风险剂量，然后根据实验动物药理学方法设计低、高剂量值[7]。三个剂量的剂量倍数为3.16倍，且剂量均在奶牛的安全范围内。

1.4.3 样品的采集

实验牛采用韦斯伐里亚转盘式机械挤奶系统进行榨乳，在榨乳前后都对设备进行充分自动清洗。本研究每天上午进行奶样的采集。第一次灌喂药物前采集的奶样为第0天的样品，此后以此类推喂药后第1，2，3，……天。采样瓶采集的奶样分装到50 mL酸清洗过的聚乙烯塑料离心管中（一式三份），将采集的样品进行编号，立即放入-20℃冰箱内保存。

1.4.4 样品中铬的测定

（1）样品前处理。称取约5 g奶样（精确到0.001 g）于50 mL玻璃消解管中，加入10 mL 9∶1混酸（硝酸∶高氯酸），加盖浸泡过夜进行预消解，过夜消解后再将消解管放到电热消解仪上先在100℃下加热消解，待消解液呈黄色透明状态时，将温度逐步提升（120～150℃），最后升高到180℃以上加热消解赶酸，若样品变为黑色，则滴加数滴浓硝酸继续消解直至黑色消失，待加热到样品近干后，取下消解管冷却后用2%硝酸定容到50 mL，充分摇匀待上机检测。同时做3个平行试剂空白。

（2）仪器条件。参考GB/T 5009.123-2003《食品中铬的测定》[8]，并结合仪器推荐的条件进行优化。石墨炉原子吸收光谱仪工作参数：波长357.87 nm铬空心阴极灯，灯电流为8 mA，狭缝宽度为0.7 nm；进样量为20 μL；背景校正为氘灯；基体改进剂5 μL质量分数为2%磷酸二氢铵溶液，升温程序如表2所示。

表2 铬检测的石墨炉升温程序

（3）标准曲线的绘制。

把50 μg/L铬标准工作液倒入样品杯中，放在系统所编辑的样品盘的杯位，仪器根据编辑好的浓度梯度进行梯度稀释并自动引入样品标准溶液，稀释液为超纯水。铬的标准溶液质量浓度分别为0，10，20，30，40，50 μg/L。仪器测量由低质量浓度到高质量浓度，进样量为20 μL。铬的校准曲线校准类型为Linear Through Zero，采用外标法进行测量，以标准物质的浓度为自变量，元素吸光度为因变量，利用仪器AA WinLab软件处理做线性回归，绘制出标准曲线，并得到相关系数，以用于样品浓度的测量。

1.4.5 统计分析

实验数据用Excel 2007进行初步统计，用SPSS 20.0软件对数据进行分析，不同处理组、不同时间内的平均值比较用LSD和Duscan氏进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线线性范围

标准曲线在0～50 μg/L范围内线性相关系数(R2)为0.999，线性良好，可以用于样品中铬的测定，标准曲线如图1所示。本方法用于原料乳中铬的含量的检测检出限可达0.005 mg/kg。

图1 铬检测的标准曲线

2.2 回收率与精密度

分别向5 g牛奶加入0.25 mL质量浓度为1 μg/L的铬标准溶液，0.5 mL的1 μg/L的铬标准溶液，0.1 mL质量浓度为10 μg/L的铬标准溶液，得到加标质量分数水平分别为0.05，0.10，0.20 mg/kg的3组样品，每组做5个平行，同时做空白样品组。进行回收率实验，结果如表3所示。由表3可以看出，铬检测平均回收在93.53～95.55%范围内，满足检测要求，相对标准偏差在2.59～3.67%的合理范围内。

表3 铬的加标回收率和精密度

2.3 饲喂烟酸铬对牛乳中铬含量的影响

根据所建立的样品前处理方法和石墨炉原子吸收光谱法的仪器条件，分别对低、中、高剂量组的奶牛的奶样中铬浓度进行检测，对每组中奶牛样品铬浓度取平均值和标准偏差，利用EXCEL软件以时间点天数(d)为横坐标，牛乳中铬的质量浓度(mean±SD)为纵坐标，绘制乳中铬浓度随时间变化规律的曲线，分别见图2～4。

图3 中剂量组牛乳中铬质量分数—时间曲线

图4 高剂量组牛乳中铬质量分数—时间曲线

由图2～图4可以看出，给奶牛饲喂低、中、高剂量铬后，牛乳中铬的含量无明显的升降趋势，铬含量维持在一个相对恒定的浓度范围内，且个头牛之间的个体差异较大。为进一步研究不同剂量组对奶牛泌乳中铬的含量影响，将三个剂量组的实验数据分为7组，分别为饲喂前对照组（0 d）、饲喂1～10 d组、饲喂11～20 d组、饲喂21～30 d组、饲喂31～40 d组、停药后1～17 d组、停药后18 d至实验结束组。利用SPSS软件对6组数据进行单变量方差分析，分析结果如表4所示。

表4 饲喂不同剂量的烟酸铬对不同时期牛乳中铬质量分数的影响 mg/kg

由表4可以看出，连续饲喂奶牛0.47 g剂量的铬40 d，与铬饲喂前的对照组相比，奶牛在喂药及停药期间乳中铬的含量无显著变化(P＞0.05)，停药后1～17 d期间较饲喂1～10d期间，牛乳中铬的含量升高，差异显著(P＜0.05)；连续饲喂奶牛1.5 g剂量的铬40 d，饲喂21～30 d期间，牛乳中铬较铬饲喂前的对照组含量升高，差异显著(P＜0.05)，其余时间内牛乳中铬的质量分数无显著性变化(P＞0.05)；连续饲喂奶牛4.74 g剂量的铬40 d，饲喂21～40天期间，牛乳中铬较铬饲喂前的对照组质量分数升高，差异显著(P＜0.05)，其余时间内牛乳中铬的质量分数无显著性变化(P＞0.05)。各剂量饲喂组牛乳中铬的质量分数低于国家标准生鲜乳中铬的限量值0.3 mg/kg[6]。本研究中，中剂量组和高剂量组中分别有一头奶牛因乳房炎和右后腿受伤而接受治疗，统计分析中把接受治疗的奶牛去除，这不会影响对统计分析结果的准确解释[8]。

K.E.Lloyd[9]等人为评价铬添加对牛乳及肉中铬的残留量的安全性，对奶牛产前30 d及产后90 d进行了为期120 d的铬添加饲喂，添加方式为向奶牛日粮中添加丙酸铬，相当于质量分数为2 mg/kg的铬。研究结果表明，铬的添加对奶牛乳、肌肉及脂肪等人类消费产品中铬的质量分数无显著影响。梁茂文[10]等人向奶牛日粮中添加4，8，12 mg/（头·d）的吡啶羧酸铬，对牛乳中铬的沉积影响不大(P＞0.05)。詹凯[11]等人向泌乳牛日粮中添加2 mg有机铬，这对铬在乳中的沉积有一定的作用，但添加量超过一定剂量时，对铬在乳中沉积起阻碍作用。本实验中奶牛经过不同剂量水平的铬饲喂后，考虑到奶牛个体代谢差异的影响，在实验期内，尽管有少数时间段内奶牛泌乳中铬的平均质量分数略有增加(P＜0.05)，但是其余大多数时间段内牛乳中铬质量分数无显著性变化(P＞0.05)，表明口试饲喂的铬不易通过牛体向牛乳中迁移沉积。

3 结论

本研究建立的湿式消解-石墨炉原子吸收光谱法检测原料乳中铬的质量分数，此方法操作简便，稳定性好，精密度高，检测限可达0.005 mg/kg，适用于原料乳中重金属铬的检测。

本研究15头泌乳期奶牛以烟酸铬形式分别饲喂0.47，1.50，4.74 g/d的铬，连续饲喂40 d。不同剂量铬的饲喂对奶牛泌乳中铬的质量分数无显著影响，牛乳中铬的质量分数无明显的升降趋势，铬的量维持在一个相对恒定的质量分数范围内，且铬在牛乳中呈现非剂量相关型残留，表明饲料中铬不易向牛乳中迁移。乳中总铬质量分数低于0.3 mg/kg，符合国家标准GB2762-2012《食品中污染物限量》对生鲜乳中总铬的限量值(0.3 mg/kg)。

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