miR-142-3p对小鼠泌乳量、乳成分及乳腺组织结构的影响

栾生，谢雪娇，郝雨蒙，王媛，王春梅，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

0 引言

microRNA(miRNA)是一类基因调节因子，在细胞增殖、分化、凋亡过程中发挥调节作用[1]，microRNA通过调控其靶mRNA的稳定性和翻译来效率调节生物学反应[2,3]。

miR-142-3p定位于小鼠11号染色体上，研究证实miR-142-3p参与效应T细胞的活化[4]，经常在新生组织被检测到[5]，miR-142-3p在胰腺癌组织表达量降低[6]，在外周血单核细胞中的表达与手术移植后的耐药性有关[7]，miR-142-3p可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[8]。

我们前期的研究发现，miR-142-3p可对泌乳相关基因Prlr进行调控，直接或间接影响乳腺上皮细胞的增殖与泌乳（资料待发表）。

为进一步阐明miR-142-3p的体内作用，本研究拟通过尾静脉注射，改变miR-142-3p在小鼠乳腺中的表达量，在整体和组织学水平研究miR-142-3p对泌乳量、乳成分及乳腺组织结构的影响，为人工调控乳产量和乳品质奠定基础。

1 实验

1.1 材料

实验动物：研究所选取的孕鼠均为健康的昆明小白鼠，在相同的实验环境及饲喂条件下饲养。

试剂：miR-142-3p的模拟物mimics、抑制剂inhibitor、阴性对照试剂negative c ontrol均由上海吉玛生物有限公司设计并合成。

仪器：丹麦福斯MilkScan FT120乳品成分快速检测仪、光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 miR-142-3p过表达的影响

（1）尾静脉注射。待孕鼠分娩后，每只母鼠配置8只仔鼠，母鼠尾静脉注射药物，注射剂量为100 ng/mg体重。实验共分3组：①过表达组：miR-142-3p的模拟物mimics；②阴性对照组：阴性对照试剂negative control；③空白对照组：生理盐水。每组设置3个平行。

（2）48 h泌乳量测定。仔鼠出生后前15日完全靠吸吮母乳生长，所以称量仔鼠体重变化，间接反应母鼠的泌乳量变化[9]。本实验测定2日内泌乳量。测量方法：分组及处理同1.2.1（1），以4 h为1个哺乳单位，即隔离3 h，哺乳1 h，称量并记录哺乳前、后仔鼠体重变化，记录截止到第48 h，期间共测定12次，将12次所得的结果相加所得的值，即为48 h的泌乳量。

（3）乳成分分析。分组及处理同1.2.1（1），注射试剂48 h后收集母鼠乳汁，采用丹麦福斯MilkScan FT120乳品成分快速检测仪分析不同实验组母鼠乳成分变化，分析的乳品质指标主要包括：脂肪、蛋白质、非脂乳固体物、灰分、乳糖。

（4）乳腺组织结构变化。分组及处理同1.2.1（1），48 h后,颈椎脱位法处死母鼠，收集第4乳区的乳腺组织，制作组织石蜡切片，之后进行HE染色，每张切片选取5个视野观察并计算每个视野乳腺腺泡平均数。HE染色方法：①石蜡切片用二甲苯常规脱蜡；②经无水酒精、95%酒精、85%酒精、70%酒精逐级分化；③经蒸馏水转入苏木精染色液染色10 min；④1%盐酸酒精分化5～10 s，镜检，直到细胞核及核内染色质清晰为止；⑤氨水返蓝30 s；⑥流水冲洗2 h以上；⑦伊红浸染2 min；⑧梯度酒精脱水：依次经过70%酒精、75%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精脱水，其中70%酒精和75%的酒精2 min,其余约3 min；⑨二甲苯透明:10 min/次，共2次；⑩中性树胶封片，镜检。

1.2.2 miR-142-3p抑制的影响

（1）尾静脉注射。待孕鼠分娩后，每只母鼠配置8只仔鼠，尾静脉注射药物，剂量为100 ng/mg。实验共分3组，①抑制组：miR-142-3p的抑制剂Inhibitor；②阴性对照组：阴性对照试剂negative control；③空白对照组：生理盐水。每组设置3个平行。

（2）48 h泌乳量测定。实验分组及处理同1.2.2（1），实验方法同1.2.1（2）。

（3）乳成分分析。实验分组及处理同1.2.2（1），实验方法同1.2.1（2）（3）。

（4）乳腺组织结构变化。实验分组及处理同1.2.2（1），实验方法同1.2.1（2）（4）。

2 结果

2.1 miR-142-3p过表达

2.1.1 对母鼠48 h泌乳量的影响

实验期间泌乳量的统计结果如表1所示。注射Mimics组母鼠48 h泌乳量比于阴性对照组和空白组极显著减少（P＜0.01）。

2.1.2 对乳成分的影响

乳成分统计结果如表2所示，注射Mimics组母鼠乳汁成分中的蛋白质极显著降低（P＜0.01），脂肪和非脂乳固体物含量显著减少（P＜0.05），灰分和乳糖变化不显著（P＞0.05）。

表1 miR-142-3p过表达对母鼠48 h泌乳量的影响

表2 miR-142-3p过表达对乳成分的影响 %

2.1.3 对乳腺组织结构的影响

HE染色结果如图1所示。尾静脉注射Mimics之后，母鼠乳腺组织结构同阴性对照组及空白对照组相比，乳腺腺泡结构不规则，腺泡腔回缩。统计结果（表3）表明，乳腺腺泡数量显著减少（P＜0.05）。

图1 miR-142-3p过表达后乳腺组织结构的变化（400×）

表3 miR-142-3p过表达后乳腺腺泡数量

2.2 miR-142-3p的抑制

2.2.1 对母鼠48 h泌乳量的影响

统计结果如表4所示：注射Inhibitor组母鼠48 h泌乳量比阴性对照组和空白组极显著增加（P＜0.01）。

表4 miR-142-3p抑制对母鼠48 h泌乳量的影响

2.2.2 对乳成分的影响

乳成分统计结果如表5所示，注射Inhibitor组母鼠乳汁成分中的蛋白质极显著升高（P＜0.01），脂肪和非脂乳固体物含量升高（P＜0.05），灰分和乳糖变化不显著（P＞0.05）。

表5 miR-142-3p抑制对乳成分的影响 %

2.2.3 对乳腺组织结构的影响

HE染色结果如图2所示。尾静脉注射Inhibitor之后，母鼠乳腺组织结构同阴性对照组及空白对照组相比，乳腺腺泡结构清晰规则，腺泡腔扩张，腺泡腔内充满乳汁成分。统计结果（表6）表明，乳腺腺泡数量明显增加（P＜0.05）。

图2 miR-142-3p抑制后乳腺组织结构的变化（400×）

表6 miR-142-3p抑制后乳腺腺泡数量变化

3 讨论

乳腺是哺乳动物所具有的有泌乳功能的特殊腺体，是少数的几个可以重复经历生长、功能分化和退化过程的器官之一[10]。乳房组织结构由两部分组成：一部分是由乳腺腺泡和导管系统构成的乳腺实质；另一部分是由结缔组织和脂肪组织构成的乳腺间质，后者保护和支持腺体实质。所有乳汁都是由乳腺腺泡的分泌上皮细胞生成的。每一个乳腺腺泡由一层分泌上皮细胞构成，这些高度特化的上皮细胞是泌乳的基本单位。腺泡表面附有肌上皮细胞，它能在催产素的作用下产生收缩，使腺泡内的乳汁排入导管系统。乳腺上皮细胞的数目和活性与乳的产量密切相关[11]，所以增加乳腺上皮细胞数目和活性对泌乳有重要的贡献，但是调节泌乳细胞数目和活性的机制仍不清楚[12]。乳汁是乳腺生理活动的产物，其中含有初生幼仔生长发育所必须的营养物质，哺乳动物的乳汁成分很复杂，物种、食物、季节、年龄、胎次、泌乳期、个体特性等，都能影响乳汁的成分，各种哺乳动物的乳汁都含有水、蛋白质、脂肪、糖、无机盐、维生素等。

本文通过对哺乳初期的昆明小白鼠尾静脉注射miR-142-3p的模拟物及抑制剂，使miR-142-3p在整个小鼠乳腺组织中的表达量发生变化，继而研究miR-142-3p对泌乳期乳腺以及泌乳的影响。实验结果显示，注射miR-142-3p的模拟物mimics之后，母鼠的泌乳量降低，组织切片HE染色结果表明小鼠乳腺腺泡结构不规则，腺泡数量减少，腺泡腔缩小，乳成分分析显示出乳蛋白、脂肪、非脂乳固体物显著减少，乳营养品质降低。而注射miR-142-3p的抑制剂Inhibitor之后，小鼠泌乳量增加、泌乳期乳腺组织中腺泡规则清晰，腺泡数量增加，腺泡腔增大，乳营养品质提高。

综上所述，得出以下结论：miR-142-3p可以负向调控乳腺的发育、泌乳，并对乳营养品质具有一定影响。

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