热处理对牦牛乳酪蛋白胶束中酪蛋白及无机盐的影响

李启明，马莺，李琳，何胜华

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨150090）

0 引言

热处理在乳的加工过程中起着很重要的作用，不仅能提高乳的加工特性，还能延长货架期[1]。酪蛋白胶束是由酪蛋白和磷酸盐连接的一种复合物[2]。然而，在一定温度条件下，酪蛋白从酪蛋白胶束上解聚下来进入乳清中，同时导致酪胶束中无机盐的变化，影响酪蛋白胶束的稳定性。

酪蛋白的解聚与乳的pH值和温度有关，酪蛋白解聚的量随着pH值和温度的升高而增加[3]。目前利用RP-HPLC分析热处理牦牛乳酪蛋白胶束上蛋白的解聚及湿法消解法/电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定无机盐的变化较少，本文采用RP-HPLC分析热处理牦牛乳酪蛋白胶束上蛋白的解聚及湿法消解法/电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定无机盐的变化，探讨牦牛乳在热处理过程中酪蛋白胶束的稳定性。

1 实验

1.1 材料

本研究所用的实验材料是采集于四川省红原县的牦牛乳样品，采集的样品加入质量分数为0.03%的叠氮化钠并在-18℃冷冻，并迅速送回实验室进行牦牛乳热稳定性的研究。

1.2 仪器设备

Agilent 1100高效液相色谱仪；全谱直读电感耦合等离子器（Perkin-Elmer，美国）；离子色谱仪（ICS-3000，Dionex）。

2 方法

2.1 牦牛乳的热处理

取10 mL牦牛乳于25 mL具塞试管中，于油浴锅在120℃加热10 min或140℃加热2 min，边加热边振荡，加热完成后，冷却至室温。

2.2 膜过滤

将热处理和未热处理的牦牛乳经过分子量30 ku的膜过滤，膜被固定在一个平板和框架系统里(Consep 3000系列)，利用高压泵来提供循环的操作压力，酪蛋白胶束被截留，乳清及乳清蛋白透过滤膜成为滤液。

2.3 乳蛋白分析

牦牛乳蛋白分析参考Li等人的方法[4]。选用Sigma公司的牛乳酪蛋白和乳清蛋白质标准品。50 mgκ-酪蛋白 (纯度 ＞80%)，125 mgαs-酪蛋白 (纯度＞85%)，50 mgβ-酪蛋白 (纯度＞ 90%)。牦牛乳样品用流水解冻，于4℃下3 000×g离心10 min，去除脂肪。取1 mL牦牛脱脂乳分散到4 mL缓冲液中（浓度为8 mol/L尿素，165 mmol/L Tris，44 mmol/L柠檬酸钠和体积分数为0.3%的二巯基乙醇）。

RP-HPLC系统：Agilent 1100。柱类型及规格：Jupiter C4 column(250 mm×4.6 mm,300A-sized pores，5-μm sized particles)。检测波长为 220 nm，温度为30℃，进样量为20μL，洗脱液流速为0.8 mL/min。洗脱液：A和B两种洗脱液，A为色谱纯的水（加质量分数为0.1%的三氟乙酸），B为色谱纯的乙腈（加质量分数为0.1%的三氟乙酸）。洗脱条件为：上样前先用A液平衡，上样后0～40 min B液浓度从30%升到50%；40～42 min B液浓度从50%升到100%；42～43 min B液浓度为100%；43～46 min B液浓度从100%降到30%，然后再用起始洗脱液洗脱5 min。总洗脱时间为51 min。分离牦牛脱脂乳中的αs-CN，β-CN，κ-CN，α-La，β-Lg（A和B）。

2.4 钙、镁和磷元素的分析

牦牛乳中钙、镁和磷质量分数的分析按照Bocca等人的方法[5]。

2.4.1 湿法硝解

取待硝解样品4.00 g于150 mL三角瓶中，加10 mL HNO3，于电热板上徐徐加热至浓烟冒尽后，滴加H2O2至溶液无色或微淡黄色，定容至10 mL，摇匀，静止待测。（若硝解不彻底，可加少量高氯酸，若浓度太大，可稀释10倍再测）

2.4.2 样品中各元素质量分数

硝解好的样品经美国Perkin-Elmer Optima 5 300 PV全谱直读电感耦合等离子发射光谱仪测定样品中各元素质量分数。

仪器工作条件：RF功率1.3 kW，等离子气流量15 L/min，辅助气流量0.2 L/min，雾化气流量0.8 L/min，蠕动泵流速1.5 mL/min，样品冲洗时间60 s，积分时间5 s，观测方向为轴向。

2.5 磷酸盐和柠檬酸盐质量分数

2.5.1 离子色谱前处理

用HCL将牦牛乳原样的pH值调至4.6，用离心机于4 000 r/min离心20 min，取上清液3 mL，用有机系0.45 um滤膜过滤，滤出液用超纯水稀释10倍，稀释后的样品过Diomex OnGuard RP柱除去样品中的脂肪，去脂肪后的样品待测。

取未热处理样品透过液、经120℃热处理的样品透过液、经140℃热处理的样品透过液各5 g（5 mL），在冰箱中4℃沉降10 min，取上清液3 mL，用有机系0.45 um滤膜过滤，用超纯水稀释10倍，稀释后的样品过Diomex OnGuard RP柱除去样品中的脂肪，去除脂肪的样品待测。

2.5.2 样品中柠檬酸和磷酸盐质量分数的测定

将前处理好的4个样品用离子色谱仪（ICS-3000，Dionex）进行检测，测定样品中柠檬酸和磷酸盐质量分数。检测仪器工作条件：

（1）流速为1 mL/min，进样量为100 ug，离子液为KOH，柱子为IONPAC AS11-HC，温度为25℃。

（2）洗涮条件：0 min为 20 mmol；15 min为 30 mmol；25 min为20 mmol；30 min为20 mmol。

（3）计算公式：标样质量浓度（10 mg/L）/标样峰面积=样品浓度/样品峰面积。

3 结果与分析

3.1 不同温度下牦牛乳酪蛋白胶束中酪蛋白的变化

牦牛乳分别经过140℃加热2 min（120℃）加热10 min和未加热3种不同处理方式，将热处理和未热处理的脱脂乳用分子量为3×104u的膜超滤，利用RP-HPLC分析截留液中各蛋白组分的质量分数，分析不同温度下牦牛乳酪蛋白胶束的解聚和乳清蛋白的变性作用。

图1为不同温度下牦牛乳酪蛋白胶束中酪蛋白的变化，在未热处理时，牦牛乳中κ-CN的质量浓度为6.42 g/L，而分别经过140℃（2 min）和120℃（10 min）进行热处理后，牦牛乳中κ-CN的质量浓度分别为4.02 g/L和4.55 g/L，热处理后的牦牛乳酪蛋白胶束中κ-CN的质量浓度明显低于（P＜0.05)未热处理牦牛乳中κ-CN质量浓度，说明有部分κ-CN在热处理情况下从酪蛋白胶束上解聚下来进入乳清中，κ-CN从酪蛋白解聚后与热变性的乳清蛋白通过二硫键形成可溶性κ-CN/乳清蛋白复合物[6]。未加热牦牛乳中αs2-CN的质量浓度为3.78 g/L，而分别经过140℃（2 min）和120℃（10 min）进行热处理后，牦牛乳中αs2-CN的质量浓度分别为1.93 g/L和2.57 g/L，热处理后的牦牛乳酪蛋白胶束中αs2-CN的质量浓度明显低于（P＜0.05)未热处理牦牛乳中αs2-CN质量浓度，说明有部分αs2-CN在热处理情况下也从酪蛋白胶束上解聚下来进入乳清中。另外αs1-CN和β-CN也出现类似的情况。

图1 不同温度下牦牛乳酪蛋白胶束中酪蛋白的变化

3.2 不同热处理牦牛乳无机盐质量分数的变化

牦牛乳分别在140℃（2 min）和120℃（10 min）进行热处理，分别将热处理和未热处理的脱脂乳用分子量为3×104u的膜超滤。表1为采用湿法消解法/电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定不同热处理牦牛乳中Ca、Mg和P的质量分数。热处理牦牛乳超滤液中的Ca质量分数比未加热牦牛乳中Ca质量分数要低，这主要是在热处理过程中一些游离Ca参与了乳清蛋白与酪蛋白胶束的热诱导聚合作用，导致超滤液中Ca质量分数降低。

P也是与酪蛋白结合在一起，未加热牦牛乳超滤液中P的质量分数比加热牦牛乳中P的质量分数要高，可溶性P的质量分数高，牦牛乳也越稳定，牦牛乳经热处理后，可溶性P在受热情况下与酪蛋白发生了结合，从而降低了可溶性P的质量分数导致牦牛乳在加热情况下变得不稳定。未加热牦牛乳可溶性Ca/P比为0.74，而分别经140℃（2 min）和120℃（10 min）热处理的牦牛乳的Ca/P比为1.08和1.07，因此Ca/P比较低的乳热稳定性高。

表1 Ca，Mg和P在不同热处理牦牛乳中的分配 mg/kg

3.3 不同热处理牦牛乳磷酸盐及柠檬酸盐质量分数的变化

磷酸盐和柠檬酸盐也是酪蛋白胶束稳定性的重要组成成分，牦牛乳中无机盐采用ICS-3000离子色谱测定。乳中磷酸盐和柠檬酸盐与Ca和Mg结合在一起。乳中可溶性柠檬酸钙和柠檬酸镁比磷酸钙和磷酸镁结合的强度高，因此在pH值恒定或变化不大时，可溶性Ca和Mg与柠檬酸直接相关。表2为磷酸盐和柠檬酸盐在不同热处理牦牛乳中的分配。由表1可以看出，未加热牦牛乳中柠檬酸盐比加热牦牛乳中柠檬酸盐质量分数要高，而加热牦牛乳酪蛋白胶束中的磷酸盐质量分数比未加热要高，这可能是在加热情况下，游离的Ca与磷酸盐一起与酪蛋白发生了结合。

表2 磷酸盐和柠檬酸盐在不同热处理牦牛乳中的分配 mg/kg

4 结论

(1)利用RP-HPLC分析了不同温度下牦牛乳酪蛋白胶束蛋白的变化，经过140℃（2 min）和120℃（10 min）进行热处理后，牦牛乳酪蛋白胶束中κ-CN，αs2-CN，αs1-CN和β-CN发生了不同程度的解聚。

(2)采用湿法消解法/电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定不同热处理牦牛乳中Ca、Mg和P的质量分数。热处理牦牛乳超滤液中的Ca质量分数比未加热牦牛乳中Ca质量分数要高，可溶性钙高，则表现出牦牛乳由于受热作用开始不稳定。

（3）牦牛乳中无机盐采用ICS-3000离子色谱测定，加热牦牛乳酪蛋白胶束中的磷酸盐质量分数比未加热要高，这可能是在加热情况下，游离的Ca与磷酸盐一起与酪蛋白发生了结合。

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