生物发酵法处理病死猪后堆体温度及微生物含量的跟踪监测

王苗利，王贵升，孙圣福，徐 鸿，徐 聪，尹斐斐，刘丽平，陈 静

（山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南 250022）

生物发酵法处理病死猪后堆体温度及微生物含量的跟踪监测

王苗利1，王贵升2，孙圣福2，徐 鸿2，徐 聪2，尹斐斐2，刘丽平2，陈 静

（山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南 250022）

[目的]研究利用生物发酵技术对病死猪进行无害化处理后发酵堆体的温度及其微生物含量的变化情况。[方法]本试验利用温度探头分层埋堆全程记录、细菌学计数和荧光RT-PCR/RT-PCR检测等方法对临沂市沂水县某猪场的病死猪生物发酵无害化处理技术效果进行跟踪监测和评估。[结果]经21天监测发现，发酵温度最高达70℃；试验病毒均已被杀灭；细菌含量（CFU）也分别由A组的1.33×108下降至1.37×103、B组的3.26×107下降至1.62×103。[结论]研究结果表明，此场生物发酵堆体上、中、下三层中层的温度最高，最高温度出现在第3天～9天之间，达到70℃左右，堆体发酵温度受环境温度的影响较大；发酵法对病毒和细菌的杀灭效果显著。

生物发酵；平板计数；荧光RT-PCR；无害化处理

被丢弃的病畜禽尸体所带的细菌、病毒会随空气或其他途径迅速传播扩散，如果是重大动物疫病或人畜共患病，会造成重大动物疫情或人畜共患病发生，人畜生命安全就会受到威胁，经济就会受到严重损失，影响畜牧养殖业的发展[1]。病死畜禽的无害化处理是消灭传染源最有效和最彻底的措施，特别是当前正值重大动物疫病防控的重要阶段和食用农产品质量安全水平全面提升的关键时期[2]。随着畜牧业生产规模不断扩大，养殖密度不断增加，猪感染病原机会增多，病原变异几率加大，新发疫病发生风险增加。开展生物发酵法无害化处理病死猪是发展生态畜牧业的需求。

目前，国内外规模化养殖生产中常采用的畜禽尸体无害化处理方法主要包括：焚烧法，需要投入

专门设备和油、电等，可对环境造成不利影响；高温处理法，受设施的局限性非常大；掩埋法，需要专用场地，易造成地下水污染，常会留下疫情隐患；传统发酵法，对尸体坑的建设位置及建筑质量要求较高，而且处理尸体所需时间较长，后期管理难度高。因此，寻求有效、方便、环保的病死畜禽的无害化处理技术方法显得尤为必要，

生物发酵床养猪技术起源于日本民间，在日本、韩国被大力推广和广泛应用，是近年我国引进的一项新兴养猪技术，又称“自然养猪法”、“零排放养猪法”或“生物环保养法”［3］。生物发酵床养猪技术是根据微生态理论，利用自然界的微生物资源，按一定比例将其与锯末、谷壳等辅助材料、活性剂等混合和发酵制成猪圈有机垫料，使猪粪、尿中的有机物质得到充分的分解和转化，达到无臭、无味、无害化的目的，是一种无污染、无排放、无臭气的环保养猪技术[4]。对生物发酵法无害化处理病死畜禽技术进行效果追踪监测及评估，为开展病死猪无害化处理的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 法国科玛嘉显色定位培养基（批号：LOT646）、麦康凯选择培养基（批号：1303271）、TSA培养基（批号：20120829，青岛高科园海博生物技术有限公司）、法国生物梅里埃ID32E生化反应条（批号：1002551050）、荧光RT-PCR/ RT-PCR检测试剂盒

1.2 实验方法

1.2.1 温度记录 本试验于2013年7月份在临沂市沂水县某猪场进行，试验组先后设计了2组堆体试验，分别为A组、B组。同时试验对A组进行了温度追踪结果，测定时，结合生产操作，将温度记录仪探头于埋入病死猪同时埋入垫料堆中，探头埋入深度分别为距离堆体表面40～50 cm、20～30 cm及3～5 cm。连续监测整个处理周期（28天）堆体的温度变化情况，同时记录环境温度。

1.2.2 样品采集 本次实验共对两组堆体的样品进行采集，分别为A组、B组，结合生产操作，于埋入病死猪前0 d、7 d、14 d、21 d分别取样，其中A组跟踪到第28天。取样位置按照堆体对角线布置4个点，每个采样点分表层3～5 cm、中心20～30 cm、深部40～50 cm进行取样，每个样品200 g左右，塑料袋密封。

1.2.3 病毒检测 对采集的样品经过常规处理后，进行病毒检测，检测的病毒种类、检测方法和鉴定方法，见表1。

表1 病毒检测种类、检测和鉴定方法

1.2.4 细菌计数 对采集的样品进行菌落计数，方法按照GB/T 4789.28-2003进行。

样品稀释：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000 r/ min～10 000 r/min均质1 min～2 min，制成1∶10的样品匀液；用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。依次进行制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头；根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照；及时将 15mL～20mL 冷却至 46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。培养：待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。

菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。

2 结果

2.1 温度记录结果

试验对A组进行了温度追踪结果，A组结果见表2，每天温度变化趋势图见图1。

表2 A组温度记录结果

图1 A组每日平均温度变化趋势图

由表1、图1可知，通过对堆体上、中、下三层的温度一个月的追踪监测，堆体中层的温度普遍高于上、下两层的温度；堆体中层的发酵最高温度出现在第3天～9天之间，能维持约7天，达到70℃左右 ；且堆体温度变化随环境温度变化而变化，趋势吻合。

2.2 荧光RT-PCR/ RT-PCR检测样品中病毒的结果生物发酵法无害化处理病死猪对病毒的杀灭情况检测结果，见表3，不同病毒对温度的耐受力，见表4。由表3可知，B组在试验全程未检测到目标病毒。A组在0d仅检出蓝耳病毒，但也在经7d的发酵后被杀灭，直至28d均未检测出。由表4可知，大多数病毒（蓝耳病毒、伪狂犬病毒、细小病毒、流感病毒）在56℃半个小时左右就能被杀灭，传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒在60℃左右被杀灭，圆环病毒抵抗力最强，70℃15min才能被杀灭。

表3 不同时间A、B组病毒检测结果

表4 不同病毒温度耐受力

2.3 细菌计数结果 通过细菌计数可知，制堆前A组、B组样品CFU/g分别为1.33×108、3.26×107，制堆后两组样品第7、14、21天的样品CFU结果见表5。

由表5可知，发酵堆在第14天的CFU达到一

致，均为104，在第21天达到103，并趋于稳定，与第28天的CFU基本无异。

表5 A组、B组第7天、14天、21天平板计数结果（CFU/g）

3 讨论

通过对堆体温度跟踪记录可知，两组堆体的中层温度高于上下两层，且维持时间较长，因此通过定期翻堆以及对环境温度进行控制和调节，能够优化堆体发酵的效果，使堆体发酵更均匀。

通过对堆体病毒及微生物的追踪监测可知，两组无害化处理堆经过21天的处理，两组菌体含量下降明显，达到3个数量级。说明采用此无害化方法处理病死猪，其杀灭微生物的效果非常显著，理论上发酵时间设计到21天，微生物含量最低，用时最短，且发酵试验操作简单，可重复性高。

生物发酵法无害化处理病死猪是近年来新兴的生态无害化处理模式，尚无猪场生物发酵无害化处理技术效果相关的数据，因此，本试验通过对临沂猪场采取的无害化处理堆体的温度、病毒杀灭效果和微生物的含量进行了全程的跟踪监测，为生物发酵技术处理病死畜禽方面提供了可靠有效的数据，对研究、发展及推广生物发酵技术处理病死畜禽提供了有力的支撑。此法因其众多的优点受到国内外广大养殖户喜爱，但在实际应用过程中也存在一些不足的地方，例如夏季发酵舍内温度过高，若通风不好，可导致工作环境较为恶劣，因此，相关工作人员应做好相应的防护措施。另外，如何进一步提高生物发酵无害化处理病死猪的微生物杀灭效果，并进行推广，有待于进一步研究。

[1] 方焕森. 浅谈对病死畜禽无害化处理过程中存在的问题及对策[J]. 中国畜牧兽医文摘，2011，27（5）：2-2.

[2] 王联芳，朱新华. 病死畜禽无害化处理存在的问题及对策[J]. 医学动物防制，2008，24（11）：876-877.

[3] 杜晓光，武俊海.发酵床养猪PK农村户用沼气［J］.中国动物保健，2008（5）：26-28.

[4] 武华玉，乔木，彭先文，等. 对生物发酵床养猪技术的认识[J]. 畜牧与饲料科学，2009，30（6）：101-102.

（责任编辑：胡藕祥）

Monitoring of Temperature and Micro-organism Amount in Stacks of Dead Pigs Treated with Bio-fermentation

Wang Miaoli1，Wang Guisheng2，Sun Shengfu，Xu Hong，Xu Cong，Yin Feifei，Liu Liping，Chen Jing
（Shandong Province Animal Disease Prevention and Control Center，Jinan City 250022）

[Objective]The experiment was designed to study the changes of temperature and microorganism amount in stacks of dead pigs treated with bio-fermentation. [Method] Temperature detectors，bacterium counting and fl uorescent RT-PCR/RT-PCR assays were used to monitor and assess the effect of bio-fermentation in pig farms in Yishui county，Shandong province. [Result]After 21 days monitoring，it was found that the highest fermentation temperature was up to 70℃，the 2 test viruses were all killed and the bacteria content （CFU） was decreased from 1.33×108to 1.37×103in group A，and from 3.26 × 107to 1.62×103in group B. [Conclusion]The experiment showed that the mid-layer in the stack reached the highest temperature of 70℃ lasting from the third to the ninth day；the fermentation was affected signifi cantly by the environment temperature；the bio-fermentation produced signifi cant killing effect on virus and bacterium.

bio-fermentation；plate count；fl uorescence RT-PCR；harmless treatment

X713

B

1005-944X（2015）08-0027-04

病死畜禽无害化处理技术推广项目。

陈 静