山东潍坊市部分奶牛场奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性检测

薛 梅，朱俊平

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

山东潍坊市部分奶牛场奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及耐药性检测

薛 梅，朱俊平

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061）

为了解潍坊市当前奶牛乳房炎的发病以及病原菌的种类和耐药性情况，为该地区奶牛乳房炎的防治提供参考，采集潍坊市6个奶牛场临床型和隐性型乳房炎奶样各100份，进行了细菌分离和鉴定。结果细菌检出率为91.50%（183/200），细菌混合感染奶样占检出细菌奶样的84.70%（155/183）；共分离到265株细菌，其中链球菌（无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）占38.11%，金黄色葡萄球菌占34.34%，大肠杆菌占16.98%，这些是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。将这些病原菌进行药物敏感试验，结果显示，敏感率高的药物依次是头孢喹肟（80.59%）、恩诺沙星（68.35%）、头孢噻呋（68.35%）和氟苯尼考（67.51%），耐药率高的药物依次是青霉素（37.97%）、链霉素（26.16%）和四环素（10.55%）。

奶牛乳房炎；病原菌；分离鉴定；耐药性

奶牛乳房炎严重制约着奶牛产业的发展，其不仅能使牛乳产量和质量下降，还会因盲目使用抗菌药，导致耐药菌株增多，牛乳中药物残留升高，危害人类健康[1-2]。研究表明[3]，引起奶牛乳房炎的病原微生物有150多种，其种类与地域、环境等因素密切相关。及时准确地掌握本地区奶牛乳房炎病原菌的种类和耐药情况是治疗该地区奶牛乳房炎的关键。

近十年来，潍坊地区奶牛养殖业迅猛发展，奶牛乳房炎的发病率也在不断升高[4]，因此开展奶牛乳房炎病原菌调查及抗菌药耐药性检测具有重要意义。

1 试验材料

1.1 培养基

普通营养琼脂、营养肉汤、改良艾德华琼脂、S-S琼脂、麦康凯琼脂以及细菌生化微量鉴定管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；绵羊血琼脂，由山东畜牧兽医职业学院防疫与检疫实验室按郭霄峰[5]提供的方法制备。

1.2 药敏纸片

制备青霉素、链霉素、阿莫西林、阿米卡星、四环素、氟苯尼考、恩诺沙星、洛美沙星、头孢噻呋、头孢喹肟等药敏纸片的原材料，金黄色葡萄球菌（ATCC25923）和大肠杆菌（ATCC25922），购自杭州滨和微生物试剂有限公司；药敏纸片，由山东畜牧兽医职业学院动物药理实验室按贾玉萍[6]、胡桂学[7]、丁伯良等[8]提供的方法制备。

1.3 诊断试剂

LMT乳房炎诊断试剂，购自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所。

2 方法

2.1 乳样采集[9]

在潍坊市6个奶牛场，选取临床型乳房炎乳区100个和隐性乳房炎阳性（用LMT乳房炎诊断试剂进行快速诊断）乳区100个[10-11]，共采集样品200份。采样前，用碘酊消毒乳头酒精脱碘后，废弃每个乳头前2～3把奶，每份采集15～20mL乳样，盛于灭菌的锥形瓶中，标明牛号、乳区、日期等，置4℃冰箱冷藏保存。

2.2 病原菌的分离培养[12]

从每份奶样中无菌取5mL置于灭菌离心管中，3000r/min 离心10min，弃去离心管中的上层液体，吸取0.1mL沉淀物分别接种于普通营养琼脂和绵羊血琼脂平板，置37℃温箱中培养24～48h。观察菌落形态、生长特征，并进行革兰氏染色镜检。

将符合链球菌形态特征的菌株接种于改良爱德华培养基，将符合葡萄球菌形态特征的菌株接种于绵羊血琼脂平板，将符合革兰氏阴性杆菌形态的菌株接种于麦康凯琼脂培养基和S-S琼脂培养基，初步判定细菌种类，并纯化培养，将纯培养物保存于试管斜面培养基内。

如果在普通琼脂平板上形成圆形、整齐光滑、金黄色的菌落，在血液琼脂平板上形成明显的溶血环，革兰氏染色阳性，形态球形、葡萄串状排列，则初步判定为金黄色葡萄球菌。

如果在血液琼脂平板上形成圆形，光滑湿润的菌落，周围形成透明的溶血环，在改良爱德华琼脂平板上，呈浅紫色、褐色或黑色的单个菌落，革兰氏染色阳性，形态球形或卵圆形，多为短链状排列，则初步判定为链球菌。

如果在营养琼脂平板上形成圆形、整齐光滑的菌落，部分在绵羊血琼脂平板上溶血，在麦康凯琼脂上形成红色菌落，在SS琼脂上多数不生长或生长很差，生长者呈红色，革兰氏染色阴性，形态短杆状，则初步判定为大肠杆菌。

如果在SS琼脂平板上形成无色半透明、中等大小、表面光滑的菌落，则初步判定为沙门氏菌。

如果在普通琼脂平板上形成光滑、隆起、边缘整齐的菌落，培养基逐渐变为黄绿色；在血液琼脂平板上，菌落周围形成溶血环，革兰氏染色阴性，形态短杆状，单个、成对或偶尔成短链排列，则初步判定为绿脓杆菌。

2.3 细菌生化鉴定

根据孔宪刚等[13]提供的方法，将分离纯化的细菌分类增菌后，分别进行生化鉴定。将革兰氏阴性杆菌用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ—15e等进行生化鉴定；将葡萄球菌用葡萄球菌属细菌生化编码鉴定管TH—16s等进行生化鉴定；将链球菌进行CAMP试验及链球菌生化鉴定，包括马尿酸钠水解试验，甘露醇、山梨醇和七叶苷发酵试验等；将绿脓杆菌进行葡萄糖、蔗糖发酵试验，枸橼酸盐利用试验、明胶液化试验、甲基红试验、V-P试验、靛基质试验、H2S试验等。各类细菌的生化特性见表1、表2、表3。

2.4 药敏试验

按丁伯良等[8]提供的方法进行纸片扩散法药敏试验，并根据丁伯良等[8]提供的各种抗生素药物敏感试验判定标准，判定敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。

3 结果

表1 球菌的主要生化特性

表2 肠杆菌的主要生化特性

表3 绿脓杆菌的主要生化特性

3.1 细菌分离鉴定结果

100份临床型乳房炎奶样中，94份有细菌生长。其中，细菌单独感染的奶样有20份，占检出细菌奶样的21.28%；混合感染的奶样74份，占检出细菌奶样的78.72%。共分离到138株细菌。其中，链球菌（无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）62株，占44.93%；金黄色葡萄球菌47株，占34.06%；大肠杆菌16株，占11.59%。具体结果见表4。

100份隐性乳房炎奶样中，89份有细菌生长。其中，细菌单独感染的奶样有25份，占检出细菌奶样的29.09%；混合感染的奶样64份，占检出细菌奶样的71.91%。共分离到127株细菌。其中，金黄色葡萄球菌44株，占34.65%；链球菌（无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）39株，占30.71%；大肠杆菌29株，占22.83%。具体结果见表4。

总体来看，200份乳房炎奶样中，183份有细菌生长。其中，细菌单独感染的奶样45份，占检出细菌奶样的24.59%；混合感染的奶样155份，占检出细菌奶样的84.70%。共分离到265株细菌。其中，链球菌（无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）101株，占38.11%；金黄色葡萄球菌91株，占34.34%；大肠杆菌45株，占16.98%。这些细菌是引起该地区奶牛乳房炎的主要病原菌。

3.2 药敏试验结果

对奶牛乳房炎的主要病原菌采用纸片扩散法进行药敏试验。结果显示，对金黄色葡萄球菌分离株敏感率高的药物依次是头孢喹肟（83.52%）、恩诺沙星（71.43%）、头孢噻呋（70.33%）和氟苯尼考（70.33%），耐药率高的依次是青霉素（51.65%）和链霉素（42.86%）；对无乳链球菌分离株敏感率高的药物依次是头孢喹肟（71.43%）、阿莫西林（64.29%）和头孢噻呋（61.90%），耐药率高的依次是链霉素（19.05%）和四环素（16.67%）；对停乳链球菌分离株敏感的药物依次是头孢喹肟

（77.42%）、阿莫西林（70.97%）、恩诺沙星（64.52%）和青霉素（64.52%），耐药率高的是洛美沙星（16.13%）和链霉素（12.90%）；对乳房链球菌分离株敏感率高的药物依次是头孢喹肟（78.57%）、氟苯尼考（67.86%）、阿莫西林（67.86%）、头孢噻呋（67.86%）和洛美沙星（67.86%），耐药率高的是链霉素（31.82%）和青霉素（18.18%）；对大肠杆菌分离株敏感率高的药物依次是头孢喹肟（86.67%）、阿米卡星（84.44%）和恩诺沙星（82.22%），耐药率高的依次是青霉素（68.89%）和阿莫西林（17.78%）。具体结果见表5。

表4 200份乳房炎奶样的细菌鉴定结果

总体来看，奶牛乳房炎主要病原菌各分离株敏感率高的药物依次是头孢喹肟（80.59%）、恩诺沙星（68.35%）、头孢噻呋（68.35%）和氟苯尼考（67.51%），耐药率高的依次是青霉素（37.97%）、链霉素（26.16%）和四环素（10.55%）。

4 讨论

通过对潍坊市6个奶牛场100份临床型乳房炎奶样和100份隐性乳房炎奶样主要病原菌的分离和鉴定，发现临床型乳房炎奶样的病原菌检出率是94.0%，隐性乳房炎奶样的病原菌检出率是89.0%，检出率高于张广斌[4]2012年报道的64.54%，这说明病原菌感染已成为该地区奶牛乳房炎的主要致病因素。

在200份乳房炎奶样中，共检出金黄色葡萄球菌、链球菌（无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）、大肠杆菌、沙门氏菌和绿脓杆菌等7种病原菌，而链球菌（无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌）、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌是目前引发该地区奶牛乳房炎的主要病原菌，这与张广斌[4]、李振[14]等的报道一致。

细菌混合感染的奶样占总奶样的77.50%，占

检出细菌奶样的84.70%，这说明细菌混合感染已经成为病原菌感染引起的奶牛乳房炎的主要类型，这会导致奶牛乳房炎临床表现复杂，发病程度加重，治疗难度增加。

表5 潍坊市6个奶牛场奶牛乳房炎主要病原菌药敏试验结果

药敏试验结果表明，对该地区奶牛乳房炎病原菌各分离株敏感率高的药物依次是头孢喹肟、恩诺沙星、头孢噻呋和氟苯尼考，耐药率高的依次是青霉素、链霉素和四环素。

抗生素在奶牛乳房炎的防治中发挥了重要作用，但是长期应用抗生素导致了大量耐药性细菌的滋生，使得常用抗菌药物（青霉素、链霉素、四环素）很难发挥杀菌作用，而临床使用时间相对较短的药物（头孢喹肟、恩诺沙星、头孢噻呋和氟苯尼考）却有较好的杀菌效果。因此，在临床治疗乳房炎时，最好先分离细菌，通过药敏试验选择敏感药物；若没有条件进行药敏试验，可优先使用头孢喹肟、恩诺沙星、头孢噻呋和氟苯尼考等临床使用时间相对较短的药物。

[1]丁伯良，冯建忠，张国伟. 奶牛乳房炎[M]. 北京：中国农业出版社，2011：1-14.

[2]毕海林，唐达，唐建华. 奶牛乳房炎的研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012（11上）：27-29.

[3]倪春霞，胡永浩，蒲万霞，等．奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与耐药性分析[J]. 西北农业学报，2010，19（2）：20-24.

[4]张广斌. 潍坊地区奶牛隐性乳房炎主要病原菌的分离鉴定[J]. 山东畜牧兽医，2012（9）：1-3.

[5]姚火春. 兽医微生物学实验指导[M]. 北京：中国农业出版社，2001：21.

[6]贾玉萍. 奶牛乳房炎病原菌快速检测及药物敏感性试验方法研究[D]. 泰安：山东农业大学，2005.

[7]胡桂学. 兽医微生物学实验教程[M]. 北京：中国农业大学出版社，2006：71-77.

[8]丁伯良，冯建忠，张国伟. 奶牛乳房炎[M]. 北京：中国农业出版社，2011：183-189.

[9]赵战峰，宋军科，于三科. 奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定[J]. 动物医学进展，2010（4）：113-115.

[10]张广斌. 奶牛隐性乳房炎检测方法的比较研究[J]. 山东畜牧兽医，2012（8）：6-7.

[11]李晓楠. 呼和浩特地区奶牛乳腺炎发病率调查[J]. 黑龙江畜牧兽医，2013（1下）：90-91.

[12]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：132-134.

[13]孔宪刚．兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2013：135-225.

[14]李振. 临沂市奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 中国微生态学杂志，2011，23（7）：629-631.

（责任编辑：朱迪国）

Isolation and Identif cation of Pathogenic Bacteria in Cows with Mastitis in Weifang and the Drug Resistance Test

Xue Mei，Zhu Junping
（Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang，Shandong 261061）

In order to understand the cow mastitis situation，kinds of pathogenic bacteria and drug resistance status，provide

for prevention in Weifang，100 milk samples were collected from 6 dairy cattle farms each with clinical or recessive mastitis in Weifang for pathogenic bacteria isolation and identifi cation，resulting in bacteria detection rate of 91.50%. Milk samples with mixed bacteria infection reached 84.70%. 265 bacteria strains were isolated，including 38.11% Streptococcus strains（S. agalactiae，S. dysgalactiae and S. uberis），34.34% Staphylococcus aureus and 16.98% E. coli，forming the dominant pathogenic bacteria of dairy cow mastitis in Weifang. The drug sensitivity test of the dominant mastitis bacteria strains in Weifang indicated that the high sensitive drugs were cefquinome （80.59%），enrofl oxacin（68.35%），ceftiofur（68.35%）and fl orfenicol（67.51%）and the high resistant drugs were penicillin（37.97%），streptomycin（26.16%）and tetracycline（10.55%）.

cow mastitis；pathogenic bacteria；isolation and identifi cation；drug resistance

S852.61；S859.79+6

B

1005-944X（2015）08-0019-05