三氯乙烯对L-02肝细胞中SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表达水平的影响

黄爱博，洪文旭，叶金波，刘建军，许 华*

（1. 暨 南大学药学院，广东 广州 510632；2. 深 圳市疾病预防控制中心，深圳市现代毒理学重点实验室，广东 深圳 518055；3. 深 圳市人口和计划生育科学研究所，广东 深圳 518040）

三氯乙烯对L-02肝细胞中SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表达水平
的影响

黄爱博1，2，洪文旭3，叶金波2，刘建军2，许 华1，*

（1. 暨 南大学药学院，广东 广州 510632；2. 深 圳市疾病预防控制中心，深圳市现代毒理学重点实验室，广东 深圳 518055；3. 深 圳市人口和计划生育科学研究所，广东 深圳 518040）

三氯乙烯（trichloroethylene，TCE）是工业上广泛应用的一种有机溶剂，也是一种环境污染物，可通过呼吸道吸入和皮肤吸收进入人体，主要蓄积于肝脏、脑、心脏等器官，对机体产生危害作用［1-2］。体内外试验证明，TCE及其代谢产物可引起癌变、畸变及免疫毒性作用等，例如TCE对人类肾脏具有致癌作用，同时，TCE可引起人外周血淋巴细胞染色体畸变率的增高。国际癌症研究署（International Agency for Research on Cancer，IARC）在1995年对TCE致癌性分类作了修改，将其对人类非致癌改为对人类可能致癌。2011年，美国环保局在针对TCE的最终健康评估报告中，将TCE归类为人类致癌物。SET蛋白，最早因发现于患者SE的染色体畸变，被命名为SET蛋白（patient SE translocation，SET），已发现该蛋白与多种生物学活性相关，在基因表达、细胞凋亡及肿瘤发生等方面的功能正越来越受到关注［3-4］。在前期研究中，我们发现在L-02肝细胞中，SET蛋白的表达随TCE浓度的升高而上调，并证明了SET蛋白在TCE肝细胞毒性作用中起到非常重要的角色。在后续的研究中，我们应用串联纯化技术研究SET的相互作用蛋白，在SET复合物中鉴定出翻译延长因子1A1（E longation factor 1-alpha 1，eEF1A1）、翻译延长因子1A2（E longation factor 1-alpha 2，eEF1A2）及DNA损伤结合蛋白（damagespecific DNA binding protein 1，DDB1）。进一步，我们发现TCE处理可以诱发这些SET的相互作用蛋白在蛋白表达水平、亚细胞定位及与SET的相互作用发生改变［5］。本研究用人肝细胞（L-02）为模型进行体外研究，观察TCE染毒对L-02肝细胞中的这些SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1的mRNA表达水平的变化，为深入了解TCE致肝细胞毒性作用机制提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与试剂 人L-02肝细胞株，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；1640培养基、EDTA-胰蛋白酶、双抗（青霉素 链霉素）和胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco公司；RNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司；SYBRPremix Ex TaqTM逆转录试剂盒，购自日本TaKaRa公司；CCK-8购自日本Dojindo Molecular Technologies公司，三氯乙烯（ACS reagent，≥99.5%）、尿素（Urea）等其他试剂均购自美国Sigma公司。

1.1.2 主要仪器 FORMA 3111型CO2恒温培养箱，美国Thermo Forma公司；GS-15R台式冷冻离心机，美国Beckman公司；5417R型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Mx4000型实时荧光定量PCR仪，美国Shratagene公司；凝胶成像系统，英国UVI公司；Infinite M1000酶标仪，美国TECAN Group Ltd公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞毒性试验 L-02细胞接种于含10% 胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RMPI-1640完全培养基上，置37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中进行培养。采用活细胞计数试剂盒进行细胞毒性检测，接种细胞悬液100 μL于96孔板内（每孔 8 000个细胞），预先置于37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度培养箱内培养至细胞汇合度达70%～80%时，按下列分组处理：①DMSO溶剂对照组为0.5% 二甲基亚砜（DMSO）+ddH2O+无血清培养基。②TCE染毒组（分别为1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L TCE）+0.5% DMSO +ddH2O+ 无血清培养基。每组设6个复孔，24 h后，在每孔内加入10 μL的CCK8试剂，继续培养2 h后，在450nm波长处用Infinite M 1000酶标仪检测吸光度值D（450），细胞毒性检测至少重复3次。

式中，D（450）染毒为具有细胞、CCK8溶液和TCE的孔的吸光度，D（450）空白为具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度，D（450）DMSO为 具有细胞、CCK8溶液和DMSO而没有TCE的孔的吸光度。

1.2.2 生物信息学分析 利用PICASSO（protein i nteraction confidence assessment system with multiple sources）（http://61.50.138.118/PICASSO/） 分析DDB1、eEF1A1及eEF1A2蛋白与SET蛋白的相关性［6］。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测 将不同浓度的TCE（1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）暴露处理L-02细胞，以DMSO为溶剂对照，每组设3个平行样本。24 h后，对eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平进行实时荧光定量PCR测定。采用RNeasy Mini Kit试剂提取总RNA，用试剂盒将其反转录成cDNA，根据GenBank数据库eEF1A1、eEF1A2、DDB1和GAPDH基因序列，设计各mRNA引物，具体序列见表1。在对各目的基因进行相对定量之前，先梯度稀释cDNA模板进行标准曲线和熔解曲线分析，以确定荧光定量PCR的最佳反应条件及反应体系，然后采用比较阈值法（threshold cycles，Ct），以看家基因GAPDH为内参照，相对定量处理组样品内各目的基因的表达水平。反应体系为SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，50×ROX Reference Dyell 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL， cDNA 2μL，ddH2O 8 μL。扩增产物的反应程序为：95 ℃变性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以荧光定量PCR仪所附带的Mx 4000软件自动计算并分析结果，荧光定量PCR 测 定至少重复3次。

1.3 统计学方法

采用SSPS 13.0软件进行对细胞毒性试验的吸光度相对值以及eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达的相对量进行单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 TCE对L-02细胞的毒性效应

在前期研究中，我们发现染毒24 h后，TCE针对L-02肝细胞的IC50为16 mmol/L［7］。本研究选择了IC50的1/2作为最高染毒浓度。细胞毒性实验表明，与对照组比较，TCE染毒致使L-02细胞的活力显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。具体结果见图1，所有的浓度均用于后续mRNA表达水平的分析中。

2.2 SET与eEF1A1、eEF1A2和DDB1蛋白的相关性判断

PICASSO得分是评价两个蛋白生物相关性的生物信息学指标，如果PICASSO的得分超过2.0，认为两个蛋白具有相互作用。结果，eEF1A1、eEF1A2和DDB1蛋白与SET蛋白相关性的得分分别为4.6、4.6和8.8，认为这3个蛋白与SET均具有相互作用。

2.3 TCE对L-02细胞内eEF1A1、eEF1A2和DDB1mRNA表达水平的影响

2.3.1 RNA的纯度、标准曲线及熔解曲线分析 总RNA经紫外分光光度计测定，其D（260）/D（280）的比值在1.80～2.00之间，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。琼脂糖凝胶电泳显示，28 S和18 S条带清晰可见，并且28 S条带亮度约为18 S的2倍，说明所提取的总RNA无明显降解，完整性良好。

通过标准曲线分析可知，GAPDH、eEF1A1、eEF1A2和DDB1基因的扩增效率均介于90%～110%之间，且相关系数均大于0.99，说明整个PCR扩增系统工作良好，对目的基因的扩增效率接近，可以开展后续的相对定量分析。根据熔解曲线分析结果（图2）可知，GAPDH、eEF1A1、eEF1A2和DDB1基因扩增产物的熔解曲线峰均为第一峰形，未见其他峰值，峰的形状也较为锐利，提示各基因的熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠的。

2.3.2 eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平的变化 不同浓度TCE（1.0、2.0、4.0和8.0 mmol/L）处理L-02细胞后，eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平的变化见图3。结果可见，eEF1A1 mRNA表达水平在2.0 mmol/L以上TCE作用后显著增加（P＜0.05），eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平出现随着TCE浓度的增加先升高后降低的情况（P＜0.05或P＜0.01）。

3 讨 论

SET是一种具有多种生物功能的重要的细胞因子，又名模板活化因子1（template activating factor 1，TAF1），参与基因表达调控、翻译后修饰和细胞凋亡等多个生物学过程。一些消化系统、血液系统和神经系统的疾病伴有SET表达或亚细胞定位异常，提示SET与这些疾病的发生发展相关。在前期研究中，我们发现TCE可以诱发SET在L-02细胞中表达上调，沉默SET的表达可以降低由TCE引起的肝细胞毒性，证明SET在TCE诱导的肝毒性作用中扮演重要角色。我们通过串联亲和纯化和质谱鉴定方法分析SET的相互作用蛋白，在SET复合物中鉴定出eEF1A1、eEF1A2及DDB1，生物信息学分析进一步证明了eEF1A1、eEF1A2、DDB1和SET的相互作用。我们还进一步证明了TCE暴露可以诱发SET相互作用蛋白eEF1A1和eEF1A2的亚细胞定位及表达水平发生明显改变［8］。

mRNA在蛋白转录过程起到非常关键的作用，因此研究mRNA的表达水平，对进一步理解TCE诱导蛋白表达水平的改变具有重要的意义。针对前期研究结果，在已经研究了TCE对L-02肝细胞中eEF1A1、 eEF1A2和DDB1蛋白表达水平的影响基础上，我们主要探索TCE对eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平的影响。在本实验中，通过研究不同浓度TCE对eEF1A1、 eEF1A2和DDB1 mRNA表达的影响以及分析TCE对L-02细胞的增殖毒性作用，我们发现，TCE暴露处理L-02细胞后可明显影响eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA的表达并且细胞活性发生显著变化。其中，L-02经过1.0 mmol/L TCE暴露后，DDB1 mRNA的表达水平显著增高，而经（2.0、4.0和8.0mmol/L）TCE处理后，表达水平呈下降趋势。DDB1蛋白广泛参与细胞周期调控、组织器官发育分化、DNA复制、DNA损伤与修复以及基因表达的表现遗传调控等重要的生命活动［9］。因此推断可能是因低浓度TCE染毒L-02后，启动修复保护机制，DDB1 mRNA表达水平升高。但是随着TCE浓度的升高，丧失其保护机制，mRNA表达水平降低。eEF1A1 mRNA的表达水平随着TCE浓度的升高呈上升趋势。eEF1A2 mRNA表达水平与TCE处理24 h后细胞活性的变化趋势接近，即1.0 mmol/L TCE处理，表达水平上调，2.0、4.0 和8.0 mmol/L TCE处理，表达水平呈下调趋势。大量的蛋白质组学研究已表明，eEF1A可与细胞内许多分子相互作用，调节细胞内重要生理过程和机制。eEF1A1具有促进凋亡的作用，而eEF1A2则具有抗凋亡的活性［10］。eEF1A2 mRNA表达情况可能是由于低浓度TCE暴露处理对细胞产生凋亡作用，而eEF1A2具有抗凋亡作用，导致其mRNA表达水平上升，但随着TCE浓度的增加，其抗凋亡的补偿机制会逐渐减弱，致使其mRNA表达水平下降。而eEF1A1 mRNA表达水平的升高则可能是细胞为对抗TCE产生的毒性作用，通过提高eEF1A2 mRNA的表达水平对损伤进行调节修复。

本研究结果观察到TCE处理后可以引起SET及其相关蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1在mRNA表达水平的异常。且SET缺陷可以有效减缓TCE对L-02细胞的毒性作用，以及对细胞周期与凋亡的影响［7］。 然而，eEF1A1、 eEF1A2和DDB1如果通过改变表达水平参与到由SET介导的TCE的毒性作用，需要在后续工作中通过观察SET缺陷细胞株中，TCE染毒下生物学效应及这些基因在表达水平的变化，进一步明确TCE毒性作用与SET和SET相关蛋白的内在联系。

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Effects of trichloroethylene on mRNA expression of SET-associated proteins including eEF1A1，eEF1A2 and DDB1in L-02 cells

HUANG Aibo1，2，HONG Wenxu3，YE Jinbo2，LIU Jianjun2，XU Hua1，*
（1. College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632；2. Key Laboratory of Modern Toxicology of Shenzhen， Shenzhen Center for Disease Control and Prevention， Shenzhen 518055；3. Shenzhen Research Institute of Population and Family Planning， Shenzhen 518040， Guangdong， China）

目的： 探讨人L-02肝细胞经三氯乙烯（TCE）染毒后SET相互作用蛋白eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平的变化。方法：取对数生长期的L-02肝细胞，暴露于不同浓度TCE（1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）中，以DMSO为溶剂对照。24 h后，采用实时荧光定量PCR检测eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平。结果：与对照组相比，不同浓度的TCE均能够使L-02肝细胞eEF1A1、eEF1A2和DDB1 mRNA表达水平发生明显变化。其中，DDB1和eEF1A2 mRNA表达水平在低浓度（1.0 mmol/L）TCE暴露下显著升高，而随着TCE浓度的升高其mRNA表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。eEF1A1 mRNA表达水平随着TCE浓度的增加而升高（P＜0.05）。结论：TCE染毒可诱发L-02肝细胞中SET相互作用蛋白的mRNA表达水平发生改变。

三氯乙烯；细胞毒性；SET相互作用蛋白；mRNA

OBJECTIVE:To research the effects of trichloroethylene on the RNA expressions of SET-associated proteins including eEF1A1，eEF1A2 and DDB1 in L-02 cells.METHODS：L-02 cells，being in the logarithmic growth phase，were treated with different concentrations （1.0，2.0，4.0，8.0 mmol/L） of trichloroethylene for 24 h， and DMSO were used as control. The mRNA levels of eEF1A1， eEF1A2 and DDB1 were analyzed with qPCR.RESULTS：The results showed that mRNA levels of DDB1 and eEF1A2 were significantly up-regulated under low concentration of trichloroethylene（1.0 mmol/L） and were significantly down-regulated with increasing concentrations of trichloroethylene. The mRNA levels of eEF1A1 were significantly up-regulated with increasing of trichloroethylene concentration.CONCLUSION：Exposure of trichloroethylene c ould a lter m RNA e xpression o f S ET-associated p roteins i n L -02c ells.

trichloroethylene；cytotoxicity；SET-associated proteins；mRNA

R994.6

A

1004-616X（2015）01-0064-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.014

2014-05-28；

2014-10-29

国家自然科学基金（21102094）；广东省医学科研基金（A2014659 ）； 深圳市科技研究计划项目（JCYJ20130329161137543，GJH20120628151305456）；深圳市重点实验室提升项目（ZDSY2012061508 580488 9）

作者信息：黄爱博，E-mail：huangaibo@163.com。*通信作者，许 华， Email：h uax_mail@126.com