铁过量对大鼠淋巴细胞DNA损伤的影响

何丽敏，孙永叶，蔡 静，张华琦，王亚锦，马爱国*

（青岛大学医学院医学营养研究所，山东 青岛 266021）

铁过量对大鼠淋巴细胞DNA损伤的影响

何丽敏，孙永叶，蔡 静，张华琦，王亚锦，马爱国*

（青岛大学医学院医学营养研究所，山东 青岛 266021）

铁是人体必需的微量元素之一，有重要的生物学功能。据世界卫生组织2007年报道，世界范围内有10%～30%的人存在不同水平缺铁性贫血［1］，这一疾病严重影响身体状况、工作效率以及身心健康发展［2］。随着人们补铁意识的增强，膳食铁摄入增多，各种铁补充剂的使用也日渐增多，但由于机体排铁能力相对不足，过多的铁补充使铁过载更容易发生。2005年美国一项人群铁过载筛查及与遗传性血色病及慢性疾病关系的调查研究显示，美国居民铁过载（铁蛋白水平男性＞600 μg/L，女性＞500 μg/L）的总检出率为2.82%［3］。

研究表明，体内过量的铁沉积可导致自由铁的增多进而通过催化Fenton反应生成羟自由基，导致氧化应激，引起组织细胞的氧化损伤，损害机体脂质、蛋白等［4-5］，从而引起骨质疏松、肝硬化、糖尿病、心血管疾病等各种疾病［7］。DNA作为生物体最重要的遗传物质，在机体整个生命活动过程中起着重要作用，而DNA损伤能够加速细胞的衰老和凋亡、引起癌症和肿瘤等疾病。Sara等［6］研究认为，铁储存的增多可能是DNA氧化损伤以及骨吸收的危险因素，而目前铁补充过量或铁过载是否对机体细胞DNA造成严重损伤的确切研究较少，本研究以大鼠为研究对象，通过采用腹腔注射不同剂量右旋糖酐铁，拟探讨了不同剂量铁对大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

右旋糖酐铁注射液，购自浙江瑞安市制药厂，批准文号为国药准字H33021758；RMPI-1640培养基，购自Hyclone公司；胎牛血清和淋巴细胞分离液，均购自天津灏洋生物；正常熔点琼脂糖、低溶点琼脂糖和Triton X-100，均购自北京索莱宝公司；荧光剂DAPI（4´，6-diamidine-2´-phenylindole dihydrochloride）， 购自Boehringer Mannheim 公司；血清铁试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、HCl和NaOH均为国产AR级试剂；低温离心机，购自美国Sigma公司，30-30K型；低温冰箱；DYY-60型电泳仪，购自北京六一仪器厂；荧光显微镜，购自日本Olympus公司；722s分光光度计，购自上海精密仪器科学有限公司。

1.2 动物分组与饲养

SPF级雄性Wistar大鼠40只，6～7周龄，体质量（160±20） g，购自青岛派特福德白鼠养殖专业合作社，生产合格证号SCXK（鲁）20130001。大鼠于实验室适应性喂养7 d后，根据随机数字表法按体质量分为4组，每组10只：对照组、缺铁组、10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组，隔日分别腹腔注射浓度为1.25、0.45、12.50和25 mg/mL的右旋糖酐铁0.72 mL，每组分别含Fe2+0.9、0.3、9和18 mg，连续干预6周后采血进行检测。

实验期间大鼠分笼饲养，每笼5只，动物房温度22～24℃，湿度50%～60%。大鼠喂饲按照AIN-93G配方制备的基础无铁饲料［3］，自由进食，饮用去离子水。1.3测定指标和方法

1.3.1 血样采集 第6周末，大鼠禁食8 h，眼眶取血3mL，0.5%的肝素钠抗凝，立即混匀，取100 μL全血用于DNA损伤分析。其余全血经3 000 r/min离心10min，收集上层血清测定血清铁，剩余血清储存于-20℃冰箱中备用。

1.3.2 血清铁测定 采用血清铁测定试剂盒测定大鼠血清中铁含量。在酸性溶液和还原剂的作用下，运铁蛋白中铁与蛋白分离，使血清中的高铁还原成亚铁，后者与双吡啶结合成粉红色的络合物，在一定范围内，铁离子的多少与色泽成正比，使用分光光度计测定吸光度D（540）值，按下式计算血清铁浓度。

血清铁浓度（μ m o l/L）=｛［（测定管D（540）值-空白管D（540）值）］/［（标准管D（540）值-空白管D（540）值）］｝×标准浓度（35.81 μmol/L）

1.3.3 淋巴细胞DNA氧化损伤检测 采用碱性单细胞凝胶电泳法（SCGE）［8］检测大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤，本底损伤在提取大鼠外周血淋巴细胞后，直接进行铺胶-裂解-电泳-中和-染色等步骤进行SCGE分析；而使用H2O2联合本底损伤时，取同一只大鼠的外周血淋巴细胞，给予10 μmol/L的H2O2，在冰上放置5min，离心收集细胞后进行SCGE分析。“彗星”图像采用半定量分析，一个典型“彗星”图象包括头部和尾部，不同程度损伤根据可见荧光的尾部与其可见头部的比例大小而分为0、l、2、3、4共5个等级。实验分析时，每个血样观察100个“彗星”细胞［8］。

本研究使用的DNA损伤水平的单位（arbitray units，AU）［9］是一种根据头部大小、尾长及其荧光强度衡量DNA链断裂损伤程度的特有单位，把不同的分级加以换算统计，便得到DNA损伤的总体水平（DNA损伤=0级细胞数×0+1级细胞数×1+2级细胞数×2+3级细胞数×3+4级细胞数×4）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，血清铁、DNA损伤率结果以±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用LSD方法。以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 大鼠血清铁的含量

实验结束时，各组大鼠血清铁的含量存在显著差异（P＜0.01）。缺铁组、10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组与对照组相比，缺铁组血清铁显著降低（P＜0.01），而10倍及20倍铁剂量补充组血清铁显著升高（P＜0.01）；20倍铁剂量补充组与10倍铁剂量补充组比较，20倍铁剂量补充组血清铁显著升高（P＜ 0.01）。结果见表1。

表1 腹腔注射不同剂量右旋糖酐铁后大鼠血清铁含量（±s，n=10）

与对照组比较，*P＜0.01；与缺铁组比较，#P＜0.01；与10倍铁剂量补充组比较，&P＜0.01.

组别血清铁（μ m o l / L）对照组7 7 . 6 2± 10. 8 4缺铁组53. 54± 10. 9 7 * 10倍铁剂量补充组104. 7 7 ± 8 . 9 1* # 20倍铁剂量补充组205. 3± 7 . 52* # &

2.2 铁过量对淋巴细胞DNA的氧化损伤

过量补充铁后，各组大鼠均存在不同程度的DNA损伤（图1、表2）。对照组、缺铁组、10倍和20倍铁剂量补充组大鼠外周血淋巴细胞的DNA损伤率分别为16.9%、17.6%、59.7%和84.6%，与对照组相比，缺铁组DNA损伤总体水平差异无统计学意义（P=0.715），10倍和20倍铁剂量补充组DNA损伤总体水平均显著升高（P＜0.01）；10倍铁剂量补充组与缺铁组比较，10倍铁剂量补充组DNA损伤总体水平显著升高（P＜0.01）；20倍铁剂量补充组与10倍铁剂量补充组比较，20倍铁剂量补充组DNA损伤总体水平显著升高（P＜0.01）。

表2 腹腔注射不同剂量右旋糖酐铁后大鼠淋巴细胞DNA损伤总体水平（AU，±s）

与对照组比较，*P＜0.01；与缺铁组比较，#P＜0.01；与10倍铁剂量补充组比较，&P＜0.01.

组别D N A损伤分级0级1级2级3级4级本底损伤对照组8 3. 13± 5. 7 414. 13± 3. 8 31. 7 5± 1. 39 0. 50± 0. 7 6 0. 50± 1. 4121. 13± 10. 43缺铁组8 2. 40± 2. 8 412. 8 0± 5. 052. 7 0± 2. 9 8 1. 30± 1. 8 30. 8 0± 1. 48 25. 30± 9 . 0210倍铁剂量补充组40. 30± 14. 2546 . 40± 14. 105. 7 0± 2. 7 15. 40± 2. 8 8 2. 20± 2. 048 2. 8 0± 19 . 26 * # 20倍铁剂量补充组15. 38 ± 10. 08 38 . 8 8 ± 18 . 5019 . 38 ± 5. 6 013. 6 3± 6 . 48 12. 7 5± 11. 8 516 9 . 50± 43. 8 1* # &

2.3 H2O2对各组铁过量大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的影响

以10 μmol/L的H2O2诱导的对照组、缺铁组、10倍和20倍铁剂量补充组大鼠外周血淋巴细胞的DNA损伤率分别为89.5%、91.5%、96.6%和100% （图2、表3），显著高于各组大鼠本底DNA损伤率（P＜ 0.01）；缺铁组、10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组与对照组相比，缺铁组DNA损伤总体水平无明显差异（P= 0.804），10倍和20倍铁剂量补充组DNA损伤总体水平均显著升高（P＜0.01）；10倍铁剂量补充组与缺铁组比较，10倍铁剂量补充组DNA损伤总体水平显著升高（P＜0.01）；20倍铁剂量补充组与10倍铁剂量补充组比较，20倍铁剂量补充组DNA损伤总体水平升高（P＜0.05）。

表3 10 μmol/L H O对腹腔注射不同剂量右旋糖酐铁后大鼠淋巴细胞DNA损伤总体水平的影响（AU，±s）22

与对照组比较，*P＜0.01；与缺铁组比较，#P＜0.01；与10倍铁剂量补充组比较，&P＜0.05.

组别D N A损伤分级0级1级2级3级4级10 μ m o l / L H O联合本底损伤22对照组10. 50± 1. 7 7 17 . 00± 3. 3012. 7 5± 3. 1522. 50± 2. 6 237 . 25± 5. 8 5259 . 00± 15. 14缺铁组3. 7 0± 2. 7 9 17 . 30± 3. 4012. 6 0± 4. 0324. 10± 3. 7 6 42. 30± 5. 2526 0. 40± 4. 6 210倍铁剂量补充组3. 40± 2. 6 313. 6 0± 5. 4012. 10± 4. 1527 . 6 0± 13. 9 243. 30± 12. 7 529 3. 8 0± 14. 20* # 20倍铁剂量补充组012. 38 ± 1. 6 9 16 . 6 3± 2. 5020. 7 5± 4. 8 050. 25± 7 . 23308 . 8 8 ± 10. 8 9 * # &

2.4 H2O2与铁过量对大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的剂量反应关系

大鼠淋巴细胞本底损伤及10 μmol/L H2O2联合本底损伤与铁补充剂量的剂量反应关系见图3。在对照组、10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组中，DNA本底损伤水平随着铁剂量的升高而增加，10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤水平分别为对照组的3.9倍、8.0倍；经10μmol/L H2O2诱导后，大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤水平较本底损伤水平明显升高，且DNA损伤水平在对照组、10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组中随着铁剂量的增加而增加，10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤分别为对照组的1.1倍、1.2倍。

3 讨 论

右旋糖酐铁为可溶性铁，常用作临床治疗贫血患者的注射用铁剂［10］，本研究根据实验动物与人之间的剂量“等效”换算常用原则［11］，以分别给予Wistar大鼠腹腔注射不同剂量的右旋糖酐铁（铁含量0.3、0.9、9、18 mg的给药浓度）来模拟人体中各种铁剂量的情况。血清铁是评价铁负荷的特异性指标［12］，本研究结果显示缺铁组大鼠血清铁含量显著低于对照组，10倍与20倍铁剂量补充组均显著高于对照组，因此大鼠不同剂量铁负荷模型建立成功。

目前已有研究证实，机体内过多的铁可以通过催化反应生成具有高度反应活性的羟自由基，导致氧化应激，从而导致DNA氧化损伤［13-14］。本研究采用SCGE检测不同剂量铁对大鼠外周血淋巴细胞DNA本底损伤的影响，10倍、20倍铁剂量补充组大鼠淋巴细胞DNA损伤分别为对照组的3.9倍、8.0倍，且对照组、10倍和20倍铁剂量补充组的DNA损伤率分别为16.9%、59.7%和84.6%，说明10倍、20倍铁剂量补充能造成大鼠淋巴细胞DNA明显的损伤，且在铁补充过量的状况下随着铁剂量的增加大鼠淋巴细胞DNA损伤水平加重，这与既往研究结果一致［14］。经10 μmol/L H2O2诱导后，大鼠外周血淋巴细胞DNA氧化损伤水平较本底损伤水平明显加重，10倍、20倍铁剂量补充组大鼠淋巴细胞DNA损伤分别为对照组的1.1倍、1.2倍，且对照组、10倍和20倍铁剂量补充组的DNA损伤率分别为89.5%、96.6%和100%，表明10 μmol/L H2O2能对大鼠外周血淋巴细胞造成较大损伤，但由于10倍、20倍铁过量已能对DNA造成较大损伤，当增加H2O2联合后机体DNA损伤能达到100%，并不能体现H2O2对铁过载造成损伤的增加作用。

缺铁会导致贫血、免疫力低下，缺铁与癌症及癌症并发症存在关联，同时缺铁能影响癌症治疗［15］，缺铁也能影响大脑形态学、神经化学以及生物能的功能，影响神经传递和髓鞘形成［16］。目前研究缺铁导致大鼠DNA损伤的研究较少，Javier等［17］通过每天给予缺铁组大鼠铁含量5 mg/kg饲料、对照组铁含量45 mg/kg饲料来建立大鼠缺铁性贫血模型，40 d试验结束后，结果显示缺铁组大鼠DNA损伤与对照组比较无明显差别。Javier通过这一结果认为低铁造成的氧化损伤较小，机体有足够的代偿能力来防御这一损伤。本研究中，缺铁组大鼠本底DNA损伤与对照组比较差异无统计学意义，且经10 μmol/L H2O2诱导后，缺铁组DNA损伤较诱导前显著加重，但与对照组比较仍无显著差异，此结果与上述报道基本一致。

综上所述，铁补充过量能对大鼠淋巴细胞DNA产生损伤，且随着补铁剂量的增加DNA损伤加重，这一结果为日后的深入研究提供了一定的基础。本研究中10倍剂量的铁补充能对大鼠淋巴细胞DNA产生损伤，更低剂量的铁补充是否能造成损伤还有待于进一步的研究。

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The effects of iron excess on lymphocyte DNA damage in rats

HE Limin，SUN Yongye，CAI Jing，ZHANG Huaqi，WANG Yajin，MA Aiguo*
（Institute of Human Nutrition， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266021， Shandong， China）

目的： 探讨不同剂量铁补充对大鼠淋巴细胞DNA损伤的影响。方法：SPF级6～7周龄雄性Wistar大鼠40只，按体质量随机分为4组，每组10只大鼠，即对照组、缺铁组、10倍铁剂量补充组、20倍铁剂量补充组，4组均采用隔日腹腔注射右旋糖酐铁，每次注射0.72 mL，每次注射含Fe2+分别为0.9、0.3、9和18 mg，连续注射6周。4组大鼠自由饮用去离子水，喂饲无铁饲料，于第6周末眼眶取血，使用血清铁试剂盒测定血清铁浓度，采用碱性单细胞凝胶电泳法测定大鼠外周血淋巴细胞DNA损伤状况。结果：缺铁组大鼠血清铁含量为53.54 μmol/L，明显低于正常对照组的77.62 μmol/L（P＜0.01），10倍和20倍铁剂量补充组大鼠血清平均铁含量分别达到104.77 μmol/L和205.30 μmol/L，显著高于对照组（P＜0.01）。外周血淋巴细胞DNA本底损伤分析显示，缺铁组和正常对照组淋巴细胞DNA损伤总体水平分别为25.30 AU和21.13 AU，两组间差异无统计学意义（P＞0.05），10倍和20倍铁剂量补充组DNA自发损伤水平分别为对照组的3.9倍和8.0倍（82.80 AU和169.50 AU），显著高于对照组（P＜0.01）；然而H2O2与铁过量联合损伤分析显示，大鼠外周血淋巴细胞在10 μmol/L H2O2处理后，缺铁组大鼠DNA氧化损伤水平达到260.40 AU，与对照组（259.00 AU）相比差异无统计学意义（P＞0.05），而10倍和20倍铁剂量补充组分别为对照组的1.1倍和1.2倍（293.80 AU和308.88 AU），均明显高于正常对照组（P＜0.01）。结论：10倍、20倍铁剂量补充均可提高机体铁的营养状况或增加铁负荷水平；与正常铁摄入水平相比，铁缺乏未见DNA本底及H2O2联合损伤增加，而铁补充过量可引发机体外周血淋巴细胞DNA本底损伤增加及H2O2联合损伤加剧。

铁；DNA损伤；淋巴细胞；彗星电泳；大鼠

OBJECTIVE:To investigate the effects of different doses of iron supplementation on lymphocyte DNA damage in rats.METHODS：Forty male Wistar rats were randomly divided into control group，iron deficiency group，10 times-iron as control group and 20 times-iron as control group， containing Fe2+0.9，0.3，9 and 18 mg，respectively. All rats were treated with intraperitoneal injection of 0.72 mL iron dextran every other day and the entire study lasted for 6 weeks. The rats in the four groups were provided with deionized water and food without iron，both freely available. After 6 weeks，the level of serum iron was determined by spectrophotomety and the peripheral blood lymphocyte DNA damage was assessed using comet assay.RESULTS：The level of serum iron in the iron deficiency group （53.54 μmol/L） was significantly lower than that of control group （77.62 μmol/L）（P＜0.01）. In addition，the levels of serum iron in 10 times-iron （104.77 μmol/L） and 20 times-iron groups （205.30 μmol/L） were significantly higher than that of control group（P＜0.01）. DNA damage assessment indicated that there was no difference between iron deficiency group（25.30 AU） and control group （21.13 AU）（P＞0.05）. However the DNA damage of 10 times-iron group （82.80 AU） and 20times-iron group （169.50 AU） were significantly higher than control group （P＜0.01） ，being 3.9 times and 8.0 times，respectively，as control group. The results of combined DNA damage induced by 10 μmol/L H2O2showed that there was no difference between iron deficiency（260.40 AU） group and control group （259.00 AU） （P＞0.05）. The combined DNA damage of 10 times-iron group （293.80 AU） and 20 times-iron group （308.88 AU） were higher significantly than controlgroup（P＜0.01），which were 1.1 times and 1.2 times，respectively，as control group.CONCLUSION：10 times and 20times iron supplements could improve the iron nutritional status in body or increase the level of iron load. Iron deficiency could not increase the level of usual DNA damage or combined DNA damage，but iron overload could increase the level of lymphocyte DNA damage and c ombined DNA damage.

iron；DNA damage；lymphocyte；comet assay；rats

Q581，R994.4

A

1004-616X（2015）01-0059-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.013

2014-10-21；

2014-12-29

国家自然科学基金（81373000）

作者信息：何丽敏，E-mail：banxia75@163.com。*通信作者，马爱国，E-mail：m agfood@ 126.com