流式细胞术检测体外微核方法的建立

欧红梅，周长慧，涂宏刚，黄鹏程，常 艳*

（中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203）

流式细胞术检测体外微核方法的建立

欧红梅，周长慧，涂宏刚，黄鹏程，常 艳*

（中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203）

体外微核试验以微核作为遗传毒性检测终点，可用于染色体断裂剂及非整倍体诱导剂的检测，在化合物遗传毒性评价的体外试验系统中占据重要地位。2008年，欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）发布了体外微核试验可以替代体外染色体畸变试验用于遗传毒性检测的指导原则［1］。2010年，体外微核试验被经济合作与发展组织（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）指导原则TG487列入体外遗传毒性试验的选择之一［2］。2011年，体外微核试验被国际协调委员会（International Conference on Harmonization， ICH）列入指导原则S2R（1）［3］。体外微核试验检测方法简单，易于自动化［4-7］。流式细胞术作为微核自动化检测方法之一，具有高效、准确、客观及操作简单等优势［8］。

本研究的目的是建立流式细胞术体外微核检测方法，探讨此方法用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。本试验以丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）和环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）为阳性药，分别以流式细胞仪检测和人工阅片为微核检测方法，并对两种检测方法得到的微核率进行相关性分析。流式细胞术体外微核检测采用96孔板EMA和SYTOX Green双色标记技术，并加入计数珠以评价化合物诱导的细胞毒性；人工阅片采用细胞分裂阻滞法，在细胞培养皿中处理，处理完成后进行低渗、固定、滴片，读片前用吖啶橙染色。此外本文采用流式细胞术分析EMA染色情况获得细胞毒性信息，分析SYTOX G reen染色情况评价MMC和CP对细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO-K1）购自ATCC；DMEM/F-12培养基购自Corning公司；胎牛血清和Trypsin-EDTA（1×）购自Gibco公司；MMC购自Roche公司；CP和细胞松弛素B（cytochalasin B，CytoB）购自Sigma公司；S9购自Moltox公司；In V itro M icroFlow®K it 由 Litron L abs提供；6 Micron Fluorescent Latex Microspheres购自Invitrogen公司；流式细胞仪为BD公司的ACCURITMC 6。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 复苏CHO-K1细胞，培养于含10 %胎牛血清的DMEM/F12培养基中，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养条件下维持培养。每周传代2～3次，准备足够量的对数生长期细胞供试验使用。

1.2.2 受试物溶液和代谢活化系统 MMC和CP以无菌去离子水为溶剂。MMC和CP的最高浓度分别为0.2和15 μg/mL。代谢活化系统是S9和辅助因子的混合物，S9的终浓度为1%（V/V），临用前新鲜配制。

1.2.3 加样处理 加样前1天用0.25%的胰酶消化处于对数生长期的细胞，计数并调整细胞密度至所需。96孔板接种密度分别为每孔4.0×103个（-S9处理组）和6.0×103个（+S9处理组）细胞，平皿（100 mm）接种密度为每皿8.0×105～1.0×106个细胞，接种后在37 ℃、CO体

2 积分数为5%的培养条件下培养过夜。

试验分为-S9持续处理组（处理时间为24 h），选择0.06、0.13 和0.25 μg/mL 3个浓度的MMC处理；+S9短时处理组（处理时间为4 h），选择3.75、7.50和15.00μg/mL 3个浓度的CP处理。每个浓度设置 2个复孔，加样后24 h后收获细胞并进行微核检测。

1.3 流式细胞仪检测

流式细胞术体外微核检测方法不加CytoB阻滞，采用EMA和SYTOX Green双色标记技术。EMA和SYTOX Green染液包括在试剂盒中，EMA荧光信号收集在FL3通道，SYTOX Green荧光信号由FL1通道收集。EMA可穿过凋亡或坏死细胞的细胞膜，在光活化条件下与DNA以共价键结合，但无法穿过正常细胞膜与DNA结合；EMA染色结束时采用缓冲液洗细胞，并用含RNA酶及细胞膜裂解液的SYTOX Green染液染色所有细胞的细胞核。通过EMA和SYTOX Green双染料染色以区分正常细胞和凋亡、坏死细胞，达到排除凋亡或坏死细胞对试验结果的影响的目的，并加入计数珠用于评价化合物的细胞毒性。

细胞收获前可在显微镜下观察，选择合适的浓度收获细胞，制备样品并进行流式细胞术微核检测。样品检测前，用阴性对照孔调试模板，保证需要的细胞都在逻辑门内。每个浓度检测分析不少于20 000个细胞。按下式计算相对存活率和微核率。

1.4 显微镜阅片

人工阅片采用细胞分裂阻滞的体外双核微核试验，CytoB分别在加样（-S9处理组）和换液（+S9处理组）时加入，终浓度为4 μg/mL。收获细胞并进行低渗、3次固定、滴片，0.1%的吖啶橙染色。吖啶橙荧光染色的玻片不宜长期保存，故读片前染色。选择背景清晰、分散良好、染色适宜的细胞观察。每个浓度计数不少于1 000个细胞（包括单核、双核和多核细胞），并计算胞质分裂阻滞指数（cytokinesis-block proliferation index，CBPI）以评价细胞毒性。每个浓度计数不少于2000个完整的双核细胞以评价双核细胞的微核率。

其中，T：处理组；C：溶剂对照组。

1.5 结果分析与评价

CHO-K1细胞相对存活率应不低于50%±5%，如果无明显细胞毒性的限制，最高浓度为2 000 μg/mL。每一个受试物的每一个处理条件下至少需要3个可分析的浓度。至少一个浓度的微核率和溶剂对照相比有显著性差异，且有浓度-效应关系，则判定为阳性。

1.6 统计学方法

采用SAS 9.1.3软件进行统计学分析，微核率比较使用Fisher精确概率法、四格表卡方检验，以α=0.05为检验水准。人工阅片和流式体外微核检测方法的比较采用非参数Spearman系数分析［9-11］。

2 结 果

2.1 MMC体外微核试验结果

0.06、0.13 和0.25 μg/mL 3个浓度的MMC持续处理CHO-K1细胞24 h后，相对存活率均大于50%，人工阅片和流式细胞术两种方法检测的微核率与溶剂对照组相比，均呈现显著性差异（P均＜0.05），且有明显的浓度-效应关系。两种检测方法中，MMC诱导CHO-K1细胞产生的微核率均是溶剂对照组的2倍以上，且微核率倍数均随着浓度的升高而增大（见表 1）。相同浓度MMC条件下，两种检测方法得到的微核率采用SAS非参数Spearman系数分析得到rs=1.000，提示两种检测方法相关性好。

2.2 CP体外微核试验结果

3.75、7.50 和15.00 μg/mL 3个浓度的CP处理CHOK1细胞4 h后，相对存活率均大于50%，得到人工阅片和流式细胞仪两种方法检测的微核率与溶剂对照组相比，均呈现显著性差异（P均＜0.05），且有明显的剂量-效应关系（见表1）。两种检测方法得到中，CP诱导CHO-K1细胞产生的微核率均是溶剂对照组的2倍以上，且微核率倍数均随着浓度的升高而增大（见表 1）。相同浓度CP条件下，两种检测方法得到的微核率采用SAS非参数Spearman系数分析得到rs= 1.000，提示两种检测方法相关性好。

2.3 细胞毒性检测结果

MMC和CP作用于CHO-K1细胞后，EMA阳性区域荧光信号增强，且随着MMC和CP浓度增加荧光信号增强（见图1、2）。提示EMA阳性可作为细胞毒性初步判断的依据。

2.4 细胞周期检测结果

流式细胞仪自动化检测方法可以通过SYTOX Green在FL1通道的荧光信号面积定性分析化合物对细胞周期的影响。图中为正常细胞周期信息，靠近坐标原点的荧光信号峰为G1期，强度更大的荧光信号峰为G2/M期。本试验中，MMC和CP对细胞周期的阻滞主要表现在G2/M期，且随着浓度增加，G2/M期荧光信号呈增强趋势（见图 3、4）。

3 讨 论

本试验中，MMC和CP两个经典的遗传毒性化合物采用流式细胞仪检测得到的结果均为阳性，与文献报道一致［9-10，12］。在有/无代谢活化系统的条件下，流式细胞仪自动化检测方法和人工阅片的方法的Spearman 系数rs=1.000，相关性好。因而，本实验室初步建立了96孔板流式细胞术体外微核检测方法。此方法的优点主要包括：①流式细胞仪检测可以明显缩短分析时间，每个孔进样检测的时间约3 min，比人工阅片的方法快40～100倍；②96孔板流式细胞术检测方法样品处理简便，贴壁细胞样品处理可直接在孔板中完成而无需消化、离心，传统人工阅片方法消化、低渗、3次固定及离心操作则耗时费力；③减少了细胞和待测化合物的使用量，96孔板需要的细胞数及化合物用量仅为平皿用量的1/100；④可进行高通量的检测，特别适用于化合物早期遗传毒性的筛选；⑤EMA和SYTOX Green双色标记可排除凋亡、坏死细胞碎片对微核的干扰，依据EMA阳性率可初步判断细胞毒性大小；⑥可以提供细胞周期信息，定性分析待测化合物对细胞周期的影响；⑦计数珠用于评价细胞毒性有助于减少因过度细胞毒性引起的假阳性结果。

下一步我们将选择不同遗传毒性强度和不同作用机制的遗传毒性化合物以及非遗传毒性的化合物进行验证，分析此方法的灵敏度和特异性。此外体外遗传毒性试验假阳性率高倍受研究者们关注，过度细胞毒性、p53基因型、代谢活化系统和细胞系遗传稳定性等是重要影响因素［13-17］。选择p53野生型细胞、接近人代谢活化系统的细胞及基因型稳定的细胞研究也是我们的努力方向。

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Establishment of flow cytometric in iin viittrro micronucleus assay

OU Hongmei，ZHOU Changhui，TU Honggang，HUANG Pengcheng，CHANG Yan*
（China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation & Research， Shanghai 201203， China）

目的： 建立96孔板流式细胞术体外微核自动化检测的方法，并探讨其用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的可能性。方法：试验分为+S9短时处理组（4 h）和-S9持续处理组（24 h），分别选择3个不同浓度的环磷酰胺和丝裂霉素C处理CHO-K1细胞，24 h后收获细胞。采用EMA和SYTOX Green双色标记，流式细胞仪分析96孔板的微核率，并与常规标准平皿培养、细胞分裂阻滞法的双核微核结果进行比较。结果：在有或无S9处理条件下，不同浓度的环磷酰胺、丝裂霉素C诱导产生的微核率较溶剂对照组均显著增加（P均＜0.05），剂量-效应关系明显。两种微核检测方法的Spearman相关系数（rs）为1.000。结论：流式细胞术检测环磷酰胺、丝裂霉素C作用于CHO-K1细胞的微核试验结果均为阳性，与文献报道一致，因而本试验初步建立了流式细胞术体外微核检测方法。流式细胞术检测微核的方法与人工阅片的方法相关性好，提示该方法用于化合物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价具有良好的前景。

CHO-K1细胞；体外微核试验；流式细胞术；96孔板

OBJECTIVE:Establish the flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells，and explore the possibility of this method for early genetic toxicity screening during drug discovery. MEHTODS：The test included treatment with and without metabolic activation. For the treatment with metabolic activation，CHO-K1 cells were treated with three different concentrations of cyclophosphamide in the S9 mix medium for 4 h，then incubated with S9-free fresh medium for 20 h. For the treatment without metabolic activation，cells were incubated with three different concentrations of mitomycin C continuously for 24 h. In all cases，after a total of 24 h since initiation of the treatment，cells were processed for microscopic scoring or flow cytometric MN analysis. A flow cytometric method for scoring MN used EMA and SYTOX Green to label the cells in 96-well microplate，and then compared with cytokinesis-block micronucleus assay in cell culture disks based on microscopy.RESULTS：Mitomycin C and cyclophosphamide at different concerntrations caused statistically significant and dose-dependent increasess in micronucleus assay. Non-parametric Spearman's coefficients （rs） is 1.000.CONCLUSION：Similar to literature published， mitomycin C and cyclophosphamide induced positive results in flow cytometric based in vitro micronucleus assay. So the method of flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells was established. The concordance between microscopic scoring and flow cytometric was good，therefore this method is promising for screening and evaluating genetic toxicity of chemicals.

CHO-K1 cells；in vitro micronucleus assay；flow cytometric；96-well microplate

R394.6

A

1004-616X（2015）01-0039-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.009

2014-08-13；

2014-12-21

国家十二五重大新药创制专项基金资助项目（2012ZX09505001-003）

作者信息：欧红梅，E-mail：hongmei_ou@126.com。*通信作者，常 艳，E-mail：y chang@ncdser.com