单一方式复制膝骨关节炎动物模型的特点与局限性分析

段文秀，胡　玲,2，吴子建,2，龚长萍，许　静，李前辉，王　洁,2

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥　230038；2.安徽中医药大学针灸经络研究所，安徽 合肥　230038)



单一方式复制膝骨关节炎动物模型的特点与局限性分析

段文秀1，胡玲1,2，吴子建1,2，龚长萍1，许静1，李前辉1，王洁1,2

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥230038；2.安徽中医药大学针灸经络研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]单一方式复制的膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)动物模型主要包括自发性KOA动物模型和实验诱导性KOA动物模型。自发模型包括自然发生模型和转基因模型。实验诱导性KOA模型主要包括化学模型和机械模型。每种模型复制方法均存在一定的优势和不足，需要结合实验需要选择适宜的动物和适当的模型复制方法，并对模型复制方法进行反复操作，必要时可以根据实验需要对模型复制方法进行改良。

[关键词]膝骨性关节炎；动物模型；单一方式

膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种累及膝关节的慢性退行性关节疾病，主要表现为膝关节疼痛和活动障碍。随着人口老龄化的推进，人口结构特征的改变，KOA的发病人数也呈递增趋势，这种发病趋势将给社会带来巨大的医疗负担[1]。创伤、机械因素、炎症都会引起KOA。此外年龄、代谢异常以及内分泌疾病等也可能影响KOA的进展。关节软骨退行性病变是KOA病理改变的核心环节。此外，病理改变还涉及到软骨下骨、关节囊、滑膜、滑液等。KOA动物模型的复制可以分为单一方式模型和复合模型。单一方式模型应用广泛，笔者综述近年来单一方式复制KOA动物模型研究的概况，分析其造成KOA的机制，并对不同模型的特点及其局限性进行探讨。

单一方式复制的KOA动物模型主要包括自发性KOA动物模型和实验诱导性KOA动物模型。自发模型包括自然发生模型和转基因模型。实验诱导性KOA模型主要包括化学模型和机械模型。化学模型是通过关节腔内注射药物或者全身给药方式引起关节内成分代谢发生改变来诱发关节软骨改变。机械模型通过手术和关节固定改变关节应力分布，并通过引起滑液成分改变的机制诱发关节退行性病变。

1自发性模型

自发性模型指基本在自然条件下获得，未经过刻意的人工处理的KOA模型，包括自然发生模型和转基因模型。

1.1自然发生的KOA模型一些实验室动物，如豚鼠、叙利亚仓鼠、狗和非人灵长类动物可以形成自发KOA，以Hartley豚鼠模型应用较多。McDougall等[2]研究发现Hartley豚鼠约3个月可在胫骨平台中间形成对称的病灶。梁震等[3]研究发现雌性Hartley豚鼠90 d时其关节软骨有中度以上的损害，210 d的豚鼠关节软骨进一步被破坏，有明显的KOA表现。

1.2转基因模型由于小鼠的基因及可标记基因已被很好的注释、翻译，因此，KOA的转基因模型常选用小鼠。KOA的转基因模型的一些范例包括STR/ORT小鼠，其表现出增加的氧化应激以至诱导KOA[4]。过量的组织蛋白酶K会导致骨关节炎的缺陷，基质金属-13的表达也可以诱导软骨破坏[5]。Salminen等[6]研究发现Del1转基因小鼠3个月时膝关节关节软骨形成表浅原纤维，继而引起软骨硬化、半月板退变及软骨下骨裸露等KOA病变。

自发性KOA动物模型成功率高，软骨形态学改变与年龄和体质量相关联，病理改变过程最接近人类KOA的自然过程。该模型在研究KOA的病因及软骨病理改变等方面有优势。自发性模型常以鼠类为模型动物，而在研究KOA鼠模型时应注意，鼠的关节几何形状与人类稍有不同；另外鼠类关节软骨不含硫酸角质素，而人类关节软骨内此物质随年龄而增多，以鼠类为KOA模型动物时，在分析结果时应考虑该方面的差异。转基因模型主要以小鼠模型为主，小鼠与人类的基因谱差异较大，因而并不能完全模拟人类KOA。且小鼠只能获取少量组织学标本，不利于对其进行组织学的研究。自发性模型发展缓慢，时间周期较长，价格较高等也是限制其在动物实验中应用的因素。

2诱导性KOA模型

诱导性KOA模型主要包括化学模型和机械模型。其中，化学模型的诱导方式可分为关节腔内注射药物和全身给药。机械模型的诱导方式有关节外手术、关节内手术和关节固定术。

2.1化学模型化学模型的复制方法包括关节腔内注射药物和全身给药。其通过药物直接或间接作用于关节软骨的机制引起KOA。关节腔内注射的药物主要有木瓜蛋白酶和胶原酶；全身给药的常用药物为喹诺酮类抗生素。

2.1.1木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶通过水解软骨细胞外基质中蛋白多糖，分离硫酸软骨素、硫酸角质素等机制直接对关节软骨进行损伤。Patel等[7]将0.2 mL的4%木瓜蛋白酶与0.1 mL的0.03 mmol/L半胱氨酸在关节内3次注射(第1、4、7天)以诱导KOA。韩冠英等[8]用不同浓度的木瓜蛋白酶与L-半胱氨酸构成的混合溶液注入兔膝骨关节腔内，制备出病理表现严重程度不同的兔KOA模型。段文秀等[9]用0.15 mL的木瓜蛋白酶溶液与左旋半胱氨酸混合溶液注入SD大鼠膝关节腔，4周后造成早期骨关节炎模型。孙鲁宁等[10]在实验第1天抽取0.1 mL的4%木瓜蛋白酶溶液注入兔膝关节腔内，并在实验的第4天和第7天按照同样的方式重复注射，以此复制兔KOA模型。

2.1.2胶原酶胶原酶通过特异性地水解天然胶原蛋白的螺旋结构的机制直接破坏关节软骨。邓宇等[11]将0.5 mL的Ⅱ型胶原蛋白酶溶液注入兔膝关节腔内复制兔KOA模型。Botter SM等[12]将10 μL Ⅶ型胶原酶注射小鼠膝关节诱导出KOA模型，以此来观察软骨下骨表型的差异如何影响软骨损伤的发展。

2.1.3喹诺酮类抗生素在动物生长阶段，将喹诺酮类抗生素全身给药，可以导致关节和肌腱病。在犬发育阶段，喹诺酮给药可以造成关节软骨中蛋白聚糖、软骨细胞和细胞外基质的不可逆损失，表现为步态紊乱[13]。在幼年豚鼠，喹诺酮类抗生素全身给药后，关节软骨上层的退行性病变在第1天即被检测到。但是，深层组织不容易受到影响[14]。动物实验中较常用到的喹诺酮类抗生素为恩诺沙星。

关节腔内注射药物主要是通过药物对细胞外基质中蛋白多糖降解作用，破坏胶原纤维网架结构，使得软骨细胞因失去细胞外基质保护而退变、凋亡，最终导致整个软骨被破坏。木瓜蛋白酶和胶原酶均直接对膝关节的关节软骨结构进行破坏，不同之处在于木瓜蛋白酶水解软骨细胞外基质中蛋白多糖，而胶原酶水解细胞外基质中胶原蛋白。喹诺酮类抗生素是通过全身代谢变化的改变引起膝关节的退行性病变。KOA化学模型的复制操作简单，复制模型的周期短，成功率高，模型病理改变程度与药物浓度密切相关。相比于全身给药方式，关节内注射方式更为方便有效，在KOA病理改变及治疗的研究中应用较多。但使用关节腔内注射药物方法进行模型复制时，要注意不同的药物浓度会造成软骨不同程度的损伤，应根据实验需要选择合适的药物浓度。关节腔内注射药物在操作过程中针头易划伤软骨组织。此外，在实验指标的分析中需要考虑到药物的代谢规律及炎性因子含量与时间之间的变化关系。

2.2机械模型主要包括关节内手术、关节外手术以及关节固定法。主要是通过对膝关节的生理结构、血液循环或运动状态进行干预的机制来诱导KOA。

2.2.1关节内手术关节内手术方法主要有Hulth法、前交叉韧带切除术、切除半月板术、韧带切断加内侧半月板切除术。其通过破坏关节稳定组织，引起关节压力负荷传递不均衡的机制引起KOA。

(1)Hulth法由Hulth等[15]在1970年提出，切除膝关节内侧半月板、前后交叉韧带和内侧副韧带后，膝关节稳定结构遭到严重破坏，力学作用下诱使关节软骨损害。Pfander等[16]用Hulth法诱导兔KOA模型来观测低功率密度的激光对实验软骨损伤兔膝关节的影响。方锐等[17]用Hulth法构建兔KOA模型，模型复制6周即可见骨关节炎早期改变。汤晓晨等[18]用Hulth法对家兔膝关节进行手术，并于术后7 d驱赶家兔，8周后观察到软骨明显变性。

(2)前交叉韧带切除术切断前交叉韧带手术创伤小，操作相对简单。Hung LJ等[19]将前交叉韧带切断建立起兔KOA模型。袁雪凌等[20]将新西兰大白兔前交叉韧带切除，手术4周后可观察到软骨退变，术后12周软骨严重退变。刘建湘等[21]对大鼠行前交叉韧带切除术，通过对软骨进行病理观察、评分，确定成功建立起大鼠KOA模型。

(3)切除半月板术半月板切除后通过破坏膝关节的正常运动力学轴线，使关节局部承受的压力增大引起关节软骨退变。李忠等[22]切除小型猪双膝的外侧半月板，术后12周观察股骨外侧髁关节软骨变性。朱彤等[23]切除兔内侧半月板，同时用骨钻对股骨内侧髁关节软骨面进行破坏，这种模型复制方式将膝关节运动力学轴线改变与软骨的直接破坏相结合，建立起兔KOA动物模型。

(4)韧带切断加内侧半月板切除术谢靖等[24]切断小鼠内侧副韧带，用微小针头钩出内侧半月板并切除，成功建立了一种微创方式诱导小鼠发生骨关节炎的动物模型。王云峰等[25]用此方法对家兔进行手术，术后14周观察到极晚期骨关节炎改变。马文明等[26]切断SD大鼠膝前交叉韧带并切除内侧半月板，术后10周对关节软骨进行肉眼和光镜下观察，可见重度关节软骨退变改变。

关节内手术法通过手术方法破坏关节稳定组织，引起关节压力负荷传递不均衡，软骨基质的正常结构将遭到破坏，软骨细胞因失去保护作用而受损，进而引起关节软骨损伤、退变。随着关节活动的持续，会出现病程的进一步改变，可见软骨下骨裸露，软骨下骨质骨折、坏死，关节面及周围的骨质增生等。关节内手术方法多样，其中Hulth法为经典法，但其创伤大，手术感染发生率高。前交叉韧带切除术、半月板切除及前交叉韧带切除术加半月板切除术均是在Hulth法基础上作出的变通与改良，相比于Hulth法，这些手术创伤较小，出血、炎症及感染情况也有降低。关节内手术KOA模型诱导方法其力学机制与人类KOA相似，模型的可复性强，病理改变与时间相关，随着时间的延长，病理改变逐步加重。但关节内手术操作较为复杂，在手术过程中存在出血、炎症、感染等因素的影响，因此需要操作者清晰地了解膝关节组织结构，掌握熟练的操作手法，还要求实验室具备较好的实验条件。

2.2.2关节外手术关节外手术包括血管结扎和切除卵巢法。其通过影响下肢血液循环或激素代谢改变引发KOA。

(1)血管结扎黄肖华等[27]双重结扎兔股静脉，术后8周观察可见兔膝关节软骨早中期病理改变。贺文楠等[28]用结扎兔股静脉结合切断腓肠肌的方法将血管结扎与力学改变两种因素的作用进行叠加，建立起兔KOA模型。术后12周观察到晚期KOA改变。戴七一等[29]对兔下肢静脉进行结扎，8周后可见关节软骨明显缺损及骨赘形成等早中期骨关节炎病理改变。

(2)卵巢切除绝经后妇女雌激素缺乏会增加KOA的风险[30]。因此，要研究KOA的这个潜在原因，需要复制卵巢切除致雌激素缺乏的KOA动物模型。成熟大鼠卵巢切除后骨关节炎动物模型已经被证明与人类绝经后骨关节炎的表现类似[31]。刘振峰等[32]采用卵巢切除法复制大鼠KOA模型。

下肢血管结扎法会造成静脉回流受阻，骨内静脉瘀滞会引起骨内高压。骨内高压的持续状态使软骨细胞分泌基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-3增多，软骨基质中胶原蛋白和蛋白多糖分解增加，软骨损伤、退变；同时骨内高压使软骨下骨发生坏死，软骨下骨硬度增加，因而软骨下骨震荡吸收能力下降，在力学作用下，进一步加重软骨损伤[33]。血管结扎法作用于关节外，不产生关节内创伤及感染，但其更适合于探讨与下肢血液循环障碍相关的KOA的研究。通过切除卵巢方式复制的KOA模型更适合于绝经后妇女KOA的相关研究。因此，关节外手术模型具有特定的适用的研究类型，应用的广泛性较差。

2.2.3关节固定法关节固定法通过影响关节滑液的渗透作用的机制引起KOA。Haqiwara Y等[34-35]将大鼠的单侧膝关节用螺钉和一个硬质塑料板刚性固定在150°的弯曲，来诱导KOA模型。Maldonado DC等[36]将Wistar大鼠膝关节固定在屈曲90°的位置，8周后发现关节软骨退变。唐进等[37]用管型石膏将兔后膝关节伸直位固定6周后，观察发现股骨内髁关节软骨表面有早期退行性病变。

关节固定法通过对膝关节的制动，直接影响关节滑液的渗透作用，使得关节软骨营养不足，且丧失了对滑膜炎症的屏障作用，引起关节软骨破坏。膝关节固定会造成膝关节周围韧带和肌肉的挛缩，致膝关节不稳定。此外固定还影响周围血液循环形成骨内高压，加剧软骨损伤。关节固定法操作较为简单，复制的KOA模型无手术创伤和关节内的影响，病理改变随固定时间的延长呈进行性加重。但其诱导的KOA模型不稳定，且动物适应性差，模型成功率较低。此外，在固定期间不适合对KOA进行局部治疗，影响对KOA进行的早期防治研究。

3结语

KOA动物模型的复制方法多种多样，采用不同的动物和不同的方法所复制的KOA模型各有其不同的特点。通过对以上单一方式复制KOA动物模型诱发KOA机制的分析，可以发现，虽然以上模型诱发KOA的机制各不相同，但都会引起关节软骨损伤继发软骨下骨改变。相比于自发性模型，实验诱导性模型应用更为广泛。但每种诱导方法在操作过程中均存在需要注意的地方。使用关节腔内注射药物方法进行模型复制时，要反复练习，在操作中尽量避免注射针头划伤软骨；使用关节内手术方法进行模型复制时，要求细心熟练操作并严格执行无菌操作，以减少出血、炎症、感染等情况的出现；使用关节固定法进行模型复制时应对固定器具进行改良，以增强动物的舒适度，减少实验动物的不适及反抗，提高模型复制的成功率。总之，复制一个相对理想的KOA动物模型，需要结合实验需求进行动物的选择、模型复制方法的选择，并对模型复制方法进行反复操作，必要时可以根据实验需要对模型复制方法进行改良。

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·综述·

收稿日期：(2015-07-20；编辑：曹健)

通信作者：胡玲，hulingtcm@126.com

作者简介：段文秀(1992-)，女，硕士研究生

基金项目：国家重点基础研究发展计划(2015CB554504)

[中图分类号]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.028