M3受体激动剂对慢性心衰大鼠心肌ICa－L及［Ca2＋］i的影响

栾海蓉，孙　健，王得利，吴　红，董　琦

M3受体激动剂对慢性心衰大鼠心肌ICa－L及［Ca2＋］i的影响

栾海蓉，孙健，王得利，吴红，董琦

摘要目的研究M3受体激动剂胆碱（choline）对慢性心力衰竭（CHF）大鼠心肌的保护作用及可能的机制。方法CHF大鼠Ⅱ型胶原酶消化分离单个心肌细胞，全细胞膜片钳技术记录L-型钙电流（ICa－L）变化；激光扫描共聚焦技术观测细胞内钙（［Ca2＋］i）变化。结果膜片钳实验结果显示，与CHF组比较，choline组ICa－L电流密度明显增高（n＝6，P＜0．01）；预敷U73122后加入choline，与choline组比较，ICa－L电流密度明显下降（n＝6，P＜0．01）。共聚焦实验结果显示，与CHF组比较，choline组［Ca2＋］i明显升高（n＝80，P ＜0．01）；与choline组比较，U73122与choline共同孵育组［Ca2＋］i升高幅度不明显（n＝80，P＜0．01）。预先给予4-DAMP可部分逆转choline升高ICa－L及［Ca2＋］i的作用。结论M3受体对CHF大鼠的心肌保护作用可能是通过Gq／11-PLC途径开放L-型钙通道，促进Ca2＋内流，使［Ca2＋］i增加。

关键词胆碱；U73122；4-DAMP；L-型钙电流；膜片钳；激光扫描共聚焦

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于慢性心脏病变或血流动力学负荷过重，引起心肌损伤，导致心室泵血或充盈功能低下的心肌疾病［1］。细胞L-型钙通道功能异常是导致心衰因素之一［2］，即造成肌浆网内Ca2＋减少，兴奋－收缩耦联过程中所需要的Ca2＋减少，心肌收缩力降低，最终导致心力衰竭。心脏M3受体通过介导钾电流（IKM3），改善细胞间电信号传导，对抗心肌缺血、减少细胞凋亡、改善心脏功能，在众多心脏疾病的发生发展中发挥重要的作用。研究［3－5］显示，病理状态下，心肌M3受体功能性表达明显增加，激动M3受体可能具有抗CHF作用。该实验运用膜片钳和激光扫描共聚焦方法探讨M3受体激动剂胆碱（choline）对CHF大鼠心肌L-型钙电流（ICa－L）及细胞内钙（［Ca2＋］i）的影响及可能的机制。

1　材料与方法

1．1实验动物

清洁级Wistar大鼠，雄性，体重250～300 g，由哈尔滨医科大学公共卫生学院提供，于屏障环境中进行饲养和实验。

1．2药品和试剂

U73122、羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、乙二醇四乙酸酯（EGTA）、胶原酶Ⅱ、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、咖啡因、choline和M3受体特异性阻断剂（4-DAMP）等均购自美国Sigma公司；Fluo-3／AM、F-127购自美国Invitrogen公司；DMSO、台氏液及KB（Krebs buffer）液试剂等均为国产分析纯。

1．3主要仪器

BL-420E生物机能实验系统购自成都泰盟科技公司；膜片钳放大器（Axopatch 200B）、膜片钳数模转换器（Digidata 1322）购自美国Axon公司；倒置显微镜（TE 2000-U）购自日本Nikon公司；三维液压推进器（MHW-3）购自日本Narishige公司；气压减震台购自美国TMC公司；温度控制仪（NBD TC2bip）购自美国Cell Micro Controls公司；微电极拉制仪（PP-830）购自日本Narishige公司；FV-300激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1．4溶液

台式液（mmol／L）：NaCl 126，KCl 5．4，MgCl21，CaCl21．8，NaH2PO40．33，葡萄糖10，HEPES 10，用NaOH调至pH＝7．4。无钙台氏液除没有CaCl2之外，还需加入含2．0 mmol／L EGTA，其

2015－05－14接收

1.5CHF模型的建立［6］

大鼠称重后腹腔麻醉。进胸腔，在右心室流出道与左心房之间距主动脉根部2～3 mm处，丝线穿过左冠状动脉主干，连同一小束心肌一起结扎，以缝线下方心肌色泽变浅、变苍白，同时心电监护肢导R波振幅明显升高，随后I、AVL导联ST段明显升高为结扎成功。术后8周，行左冠状动脉结扎大鼠进行血流动力学检测。以左心室舒张末压≥2 kPa判断CHF模型构建成功。

1.6CHF大鼠心肌细胞急性分离

大鼠麻醉后迅速开胸取出心脏，置于预冷的4℃台式液中。快速游离主动脉并逆行插管连接于Langendorff灌流装置上。先用正常台氏液以约8 ml／min的速度连续灌流约3～5 min，心脏复跳后洗去心脏内残血。然后换用无钙台氏液以12 ml／min速度灌流约20 min至心脏停止搏动后，换用含胶原酶Ⅱ和BSA的无钙台氏液继续灌流消化胶原组织以获得单个心肌细胞。当心脏变软、色泽变浅时，开始剪取少量心肌组织，每隔2 min剪取1次。将不同时间剪下的心肌组织置于装有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使单个心肌细胞从组织块上分离下来。去除残余的大块组织后置于KB液中放到4℃冰箱稳定1 h待用。所有液体使用前，用95%O2＋5%CO2饱和，用于灌流液体的温度应始终控制在（37±0．5）℃。

1．7全细胞膜片钳电生理记录［7－8］

应用全细胞膜片钳技术记录单细胞离子电流。将分离好的单细胞置于浴槽中，待贴底壁后，用测钙外液以5 m l／min恒速灌流冲洗细胞至表面清洁，选择静止、杆状、横纹清晰、折光性良好的单个心肌细胞进行封接实验。微电极充灌电极液后接触细胞并给于负压使电极尖端和细胞膜间形成高阻封接（＞10 GΩ）后用脉冲式负压抽吸破膜，形成全细胞构型，用电压钳模式下进行刺激和记录。在浴槽中加入相应药品，并记录给药3 min后的电流。电极液和细胞外液之间的液接电位（10～11 mV）形成全细胞构型前归零。数据采集前进行膜电容和串联电阻补偿，信号输入经过1 000 Hz的滤波，数据存于计算机硬盘以便分析。

1．8心肌细胞内钙测定

细胞稳定好后，取镜下观察多数为杆状且横纹清晰无颗粒的细胞用于实验，先弃去负载液，用含有100 mg／L BSA的正常台氏液预敷，然后放在37℃恒温箱中用终浓度为10μmol／L Fluo-3／AM染色30 min，离心去除染色液后，用有钙液稀释至所需的浓度（10倍物镜视野中30～40个细胞）后待用。取染好色的细胞置于浴槽中，静置贴壁5 min后，选取杆状、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验。在激发波长为488 nm，发射波长为526 nm，在Time series程序下对细胞XY平面进行扫描，间隔时间为10 s，共扫描30次，于扫描获得基础值后于第2次和第3次扫描间隙之间加入30 mmol／L 的KCl。给药组孵育10 min后加 KCl（30 mmol／L）；对照组细胞直接加KCl（30 mmol／L）。计算细胞XY平面内平均荧光强度（Fi），以Fi代表［Ca2＋］i。以Fmax（给药后最高荧光强度）与F0（给药前荧光强度）的比值代表［Ca2＋］i的荧光强度变化。

1．9统计学处理

2　结果

2.1choline和U73122对CHF大鼠心室肌细胞ICa－L的作用比较

在形成全细胞封接状态后，将细胞钳制在－40 mV，以去除钠电流的影响。测钙内外液均含CsCl，K＋被Cs－所取代，以阻断钾电流。命令电位从 －30 mV～＋50 mV，以10 mV为步阶，波宽为300 ms，此时可记录到内向钙电流。choline组（0．5 mmol／L）ICa－L电流密度（－8．06±0．59）pA／pF较CHF组（－4．86±0．57）pA／pF明显升高（P＜0．01）。给予choline前预敷M3受体阻断剂4-DAMP（3 nmol／L），ICa－L电流密度降至（－5．80± 0．65）pA／pF，与choline组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。而给予choline前预敷 U73122（3 μmol／L），电流密度则降至（－6．33±0．53）pA／pF，与choline组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。各组间峰值比较，差异有统计学意义（F＝194．448，P＜0．01）。见图1。

2.2choline对CHF大鼠心室肌细胞钙库的影响

利用激光扫描共聚焦技术观察choline对CHF大鼠心肌细胞钙库的影响。在无钙液中，给予choline （0．5 mmol／L）后，钙 Fmax／F0升至（3．87±0．32）（n ＝70），提示choline能在去除外钙的条件下引起CHF大鼠心肌细胞内钙库释放。

2.3choline和U73122对CHF大鼠心室肌细胞［Ca2＋］i的影响

正常情况下，加入30 mmol／L KCl后，细胞内钙Fmax／F0为（5．13±0．21）。与对照组比较，CHF组钙Fmax／F0明显降低至（3．95±0．53），差异有统计学意义（P＜0．01）。与CHF组比较，choline组［Ca2＋］i明显升高，Fmax／F0为（6．39± 0．62），差异有统计学意义（P＜0．01）。与choline组比较，U73122与choline共同孵育后，Fmax／F0降至（3．85±0．56），差异有统计学意义（P＜0．01）。预先给予4-DAMP可部分逆转choline升高［Ca2＋］i的作用，与choline组比较，Fmax／F0为（3．88±0．38），差异有统计学意义（P＜0．01）。U73122组与U73122＋choline共同作用组差异无统计学意义。见图2。各组间差异有统计学意义（F＝72．813 8，P ＜0．01）。

3　讨论

本研究结果表明，choline能明显增加CHF大鼠心室肌细胞ICa－L及［Ca2＋］i，M3受体 阻 断 剂4-DAMP可部分逆转choline的作用，提示激动M3受体可以增加外钙内流，从而升高心肌细胞胞内钙水平。

L-型钙通道表达下调所致心肌兴奋－收缩耦联的异常是导致心衰的原因之一。M3受体为G蛋白偶联受体，通过Gq／11激活磷脂酶 C（phospholipase C，PLC），使膜结合的4，5-二磷酸肌醇水解为1，3，4-三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）。IP3和DAG作为细胞内第二信使，分别激活IP3／Ca2＋和DAG／蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）两个信号转导途径，从而开放钙离子通道，促进内钙释放，使细胞内钙增加。本研究显示，PLC抑制剂U73122可以逆转choline增加ICa－L及升高［Ca2＋］i的作用，提示M3受体可能通过Gq／11-PLC途径调控L-型钙通道，使钙离子通道开放，细胞［Ca2＋］i增高，肌浆网内的Ca2＋容量增多，兴奋－收缩耦联过程中所需的Ca2＋增加，心肌收缩力增加，从而起到对CHF大鼠的心肌保护作用。

研究［9］显示，M3受体介导IKM3间接影响细胞内Ca2＋，使其内流减少，还能直接抑制L-型钙通道［10］，两者作用结果均使得细胞［Ca2＋］i降低。M3受体此作用可以使得心肌收缩力减弱，减少心肌耗氧，降低心律失常发生率，对缺血性心肌产生保护作用。本研究显示，M3受体还可以通过Gq／11-PLC途径开放L-型钙通道，促进Ca2＋内流，使细胞［Ca2＋］i增加，与之前作用结果相反。M3受体此作用可以增加心肌收缩力，对抗长期缺血低氧所造成的CHF。可见，在不同病理状态下，M3受体对心肌［Ca2＋］i的影响可能不同，发挥的保护机制也不相同。

本研究结果与之前研究存在较大差异，原因主要在于：①Gq／11-PLC通路与其他信号传导通路可能存在交互作用，目前的研究未考虑其它的交互因素，可能是多条通路共同参与调控的综合结果，也可能某种通路起主导作用，掩盖或抑制了其他通路的作用；②体外实验不能完全模仿体内环境，体内所处的环境较为复杂，心衰细胞可能会受到多种因素调控和影响（如神经、体液因素的干扰），而这些因素也能对其进行间接的调控。

在今后的研究中，需要进一步阐明在各种因素交互作用下，M3受体对CHF细胞的保护作用，Gq／11-PLC信号转导通路与其他通路之间的对话也是未来研究的重点，阐明其调节作用的关键环节和主要交互影响因素。预期将有针对性地对慢性疾病发生发展使用M3受体相关药物干预给于指导，发现和验证新的药物作用靶点和可能的作用途径，并为心血管疾病的防治开拓新思路和提供理论依据。

参考文献

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中图分类号R 331．31

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1422－04

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（编号：81300163）；黑龙江省教育厅科研课题（编号：12531731）

作者单位：牡丹江医学院机能学教研室，牡丹江157011

作者简介：栾海蓉，女，讲师，硕士；孙健，女，讲师，博士，责任作者，E-mail：mdjsunjian＠126．com余成分与台氏液相同。KB液（mmol／L）：谷氨酸70，牛磺酸15，KCl30，KH2PO410，MgCl20．5，EGTA 0．5，HEPES 10，葡萄糖10，用KOH调至pH＝7．3～7．4。测钙外液（mmol／L）：Tris-Cl 136，CsCl 5．4，MgCl2·6H2O 1，CaCl2·H2O 2，NaH2PO 40．33，葡萄糖10，HEPES 10，用Tris-OH调至pH＝7．4。电极液（mmol／L）：CsCl 20，MgCl2·6H2O 1，MgATP 5，EGTA 10，CsOH 110，天冬氨酸110，用 CsOH调至pH＝7．2。

Effect of M3R agonist on ICa－Land［Ca2＋］iin myocardium of chronic heart failure rats

Luan Hairong，Sun Jian，Wang Deli，et al
（Dept of Functional Medicine，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang157011）

AbstractObjectiveTo investigate the protective effectsof choline on ICa－Land［Ca2＋］iinmyocardium from rats with chronic heart failure．MethodsThe single ventricularmyocytes were isolated by use of collegenase type II，ICa－Lwas recorded by whole-cell patch clamp technique；［Ca2＋］iwas detected by laser scanning confocalmicroscope in ventricularmyocytes．Resu ltsThe normalized peak currents of ICa－Lin ventricularmyocyteswere elevated by choline group compared with those in CHF group，which could be neutralized by U73122 and partly reverted by 4-DAMP．The［Ca2＋］iinduced by KCl in ventricularmyocyteswere significantly increased by choline group，which could be suppressed by U73122 and also partly reverted by 4-DAMP．ConclusionsThe possible mechanism of protection of M3receptor involved in the protection of CHF rats is due to the open L type calcium channel，increased ［Ca2＋］ivia activation of Gq／11-PLC signal passway．

Key wordscholine；U73122；4-DAMP；ICa－L；patch-clamp technique；laser scanning confocalmicroscope