生鲜乳中皮革水解蛋白（L-羟脯氨酸）检测方法的探讨

文/赵彩会 赵佳苗 田 间 贾 青

〔农业部饲料质量监督检验测试中心（西安）〕

2009年2月6日，原卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》，其中就包括皮革水解物。皮革水解物被添加到生鲜乳中以提高蛋白质含量。皮革水解物的检测难度较大，而L-羟脯氨酸是其特征氨基酸，因此检测生鲜乳中的皮革水解物，就是检测牛奶中的L-羟脯氨酸。2009年，原卫生部指定了其参考检测方法是《乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定方法》。现在各监测机构都在用此方法。该方法的检测步骤主要为：称取一定量生鲜乳，加入盐酸，110℃水解，然后转移、定容，从中移取少量溶液调节pH值后再定容，最后进行氧化反应和显色反应，558 nm比色测定。此方法检测限低、重复性好、定量准确。同时该方法也存在缺点，在进行大批量样品检测时，过程较复杂、用时较长，尤其是每一个样品都要调节pH值。本文在该方法基础上尝试探讨了一种较为简便快捷的检测方法，即减少样品量，并进行充分稀释，省去了调节pH值和反复移取、定容步骤，直接进行氧化和显色反应。

1 试验材料和方法

1.1 主要仪器设备

分光光度计（560 nm），氮吹仪，恒温干燥箱（110℃），水浴锅（60℃），具塞玻璃水解管（10 mL，110℃）。

1.2 主要试剂

1.2.1 盐酸

分析纯。

1.2.2 缓冲溶液

将50 g柠檬酸、26.3 g氢氧化钠和146.1 g结晶乙酸钠溶于水，稀释至1 L，再将此溶液与200 mL水和300 mL正丙醇混合。

1.2.3 氯胺T溶液

将1.41 g氯胺T溶于10 mL水中，依次加入10 mL正丙醇和80 mL缓冲溶液（1.2.2），现用现配。

1.2.4 显色剂

称取10 g对二甲氨基苯甲醛，用35 mL高氯酸溶解，缓慢加入65 mL异丙醇。

1.2.5 L-羟脯氨酸标准储备液（1.0 mg/mL）

称取100.00 mg L-羟脯氨酸标准品，用少量水溶解，加入1 滴6 mol/L盐酸，再用水定容至100 mL容量瓶中，摇匀。

1.2.6 标准工作液（20.0 μg/mL）

准确吸取标准储备液（1.2.5）2.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，摇匀。

1.3 试验方法

1.3.1 测定步骤

（1）样品处理

准确称取生鲜乳2.00 g（精确到0.0001 g）于水解管中，加入浓盐酸2.00 mL和2 滴50 g/L苯酚溶液，氮吹3 min，在充氮气的状态下封口。将已封口的水解管放入110℃恒温干燥箱内，水解6 h后取出，打开水解管，将水解液用滤纸过滤到250 mL容量瓶中，并用水反复冲洗水解管和滤纸，洗液并入容量瓶中，定容，摇匀待测。

（2）标准工作曲线溶液的配制

准确吸取浓度为20.0 μg/mL标准工作液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00 mL，分别于100 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，浓度分别为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL。

（3）检测

分别准确移取配制好的标准工作曲线溶液和待测水解液5.00 mL于水解管中，加入2.00 mL氯胺T（现用现配），室温静置20 min，再加入2.00 mL显色剂，60℃水浴20 min。取出迅速冷却至室温，在560 nm波长下测定样品吸光值。

1.3.2 准确度试验

取10 支水解管，每管中准确称量2.00 g空白生鲜乳，再分别准确加入浓度为1.0 mg/mL的L-羟脯氨酸储备液0、100、200、400、500 μL，2个平行，制成空白样品和L-羟脯氨酸的添加量分别为50、100、200、250 μg/g的加标样品。各样品按1.3.1测定步骤进行检测。

1.3.3 精密度试验

取1.3.2中添加量为100 μg/g的样品，按1.3.1测定步骤重复测定6 次，计算相对标准偏差。

1.4 含量计算公式

C—从标准曲线求得的样品溶液L-羟脯氨酸的浓度，μg/mL；

V—样品溶液的体积，mL；

m—样品的质量，g。

2 结果分析

2.1 标准工作曲线的建立

按照1.3.1方法测定各个标准工作溶液的吸光度值，以L-羟脯氨酸标准工作浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标建立标准工作曲线（图1），曲线的相关系数（R2）为0.9992。

图1 标准工作曲线

2.2 方法准确度

空白样品和加标样品中L-羟脯氨酸的检测结果见表1。由于在检测中存在各种试剂的干扰，计算加标回收率时要扣除空白样品中L-羟脯氨酸的含量。扣除空白样品后，在50～250 μg/g线性范围内，加标样品中L-羟脯氨酸的回收率在87.14%～93.09%，平均回收率为90.6%，检出限为50 μg/g，方法准确度可以满足检测要求。

表1 各样品的检出量和回收率

表2 试验方法的精密度结果

2.3 方法精密度

对添加量为100 μg/g的加标样品重复测定6 次，计算检测结果的相对标准偏差（RSD），验证方法的精确度（表2），可以看出，重复测定结果的相对标准偏差仅为1.8%，方法的精密度符合检测要求。

3 讨论与结论

本试验方法与原卫生部指定的测定方法相比，不需要反复移取、定容溶液，不需要每个样品调节pH值，检测大批量样品时大大节省了样品前处理时间，因此该方法适合大批量样品的快速检测。原卫生部指定方法的最低检测限为100 μg/g，而本方法可以检出添加量为50 μg/g的加标样品中L-羟脯氨酸，且方法的准确度、精密度均可以达到检测要求。

试验过程中，如果所用试剂（如标准储备溶液、标准工作曲线溶液、显色剂）当天配制，氯胺T现用现配，检测效果会更好。由于在检测中存在各种试剂的干扰，因此计算加标回收率时要扣除空白样品含量。若用本方法检测的结果为阳性，需要用原卫生部指定方法进行复检、定量。

[1]刘学琴，徐栓朝，高建龙，等.生鲜乳中添加皮革水解蛋白的测定方法研究.乳业科学，2010（4）：188-192.

[2]孔晓峰，古丽曼，达成彪，等.紫外分光光度法测定生鲜乳中动物水解蛋白L-羟脯氨酸含量.饲料工业，2011（4）：60-61.