避孕药对不同糖质量浓度下雌性黑腹果蝇寿命的影响

王彩艳，田祯祥，刘承宜

(1.华南师范大学体育科学学院和民族体质与健康研究中心，激光运动医学实验室，广州510006;2. 中山大学生命科学学院，广州510006;3.枣庄学院体育学院，枣庄277000)

寿命是衡量衰老过程的最确切指标，黑腹果蝇(Drosophlia melanogaster)寿命只有3个月左右，适合用于寿命研究.寿命实验是通过统计生物的平均寿命(mean life span)和最高寿命(maximum life span)及其变化来衡量生命衰老规律和延缓衰老的方法［1］.Piazza 等［2］首次将黑腹果蝇引入运动生理学研究，证实了运动和饮食的抗衰老效应.低糖的膳食环境在女运动员中较多见，是引起女运动员三联征的主要原因之一，避孕药对运动成绩的影响也存在争议. 女运动员三联征即饮食失调/不规律饮食习惯、闭经/月经过少、骨密度减低(骨质疏松和骨量减少)，是女子运动中普遍存在的问题. Torstveit等［3］对精英运动员的调查显示，优秀运动员中有60.4%的人存在三联征的风险，而在有美学特性的表演类项目中这种比例高达66.4%，球类运动员的这种风险为52.6%，一些体型偏瘦的运动项目中比例达到70.1%，这些运动员应力性骨折的发生率较高.而对于模式生物黑腹果蝇来讲，对其寿命影响因素的研究可间接反映运动员身体状况的改变，从而影响运动成绩的发挥［2］.本文用雌性黑腹果蝇作为研究模型，通过探究黑腹果蝇寿命的影响因素——白砂糖和避孕药质量浓度，为女运动员的健康维护提供研究线索.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型黑腹果蝇Oregon R 品系由华南农业大学蚕桑养殖中心提供.

1.1.2 试剂与仪器 高活性酵母，安琪酵母股份有限公司生产;“佳一粒”精幼砂糖，广东中轻糖业集团有限公司生产;麦胚芽和酵母粉，安徽“燕之坊”食品有限公司生产;“妈富隆”(去氧孕烯炔雌醇片)短效口服避孕药，荷兰欧加农制药公司;丙酸，天津大茂化学试剂厂;无水乙醇，天津大茂化学试剂厂;上皿电子天平，型号FA2004，上海天平仪器厂;Eppendorf 移液枪，Germany 制造.

1.1.3 实验用培养基 培养基Ⅰ:为基本培养基，用于果蝇的传代培养，其主要成分:水100 mL，白砂糖5 g，琼脂1 g，玉米粉5 g，麦胚芽5 g，酵母粉4 g，丙酸0.5 mL.将除丙酸外的各成分混合，搅拌均匀，煮沸，快要冷却时加丙酸搅拌均匀，分装到已灭菌的培养管中.

培养基Ⅱ:探究不同糖质量浓度对果蝇寿命的影响所用的培养基，培养基配比主要成分:水100 mL，琼脂1.9 g，酵母粉3.2 g，丙酸0.87 mL，各组白砂糖质量按表1 称取，按培养基Ⅰ的方式煮培养基，其中4 号糖质量浓度为基础培养基［4］.

培养基Ⅲ:探究不同避孕药质量浓度对果蝇寿命的影响所用的培养基，根据糖质量浓度影响实验的结果，按照表1 选择1 号(低糖)、3 号(正糖)、14号(高糖)下生长的果蝇作为实验动物.去氧孕烯炔雌醇片是一种短效口服避孕药，可长期使用，其中每片含有去氧孕烯0.15 mg 与炔雌醇30 μg.按培养基Ⅰ的方式煮培养基Ⅱ中的1、3、14 号，冷却加丙酸，搅拌均匀后按每100 mL 培养基加研磨充分的去氧孕烯炔雌醇片粉末分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60 mg，搅拌均匀后分装到不同管，编号依次为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，代表培养基Ⅲ的不同组.

表1 培养基中糖的质量Table 1 The mass of sugar in culture medium g

1.2 实验方法

1.2.1 果蝇培养条件 果蝇置于恒温恒湿培养箱，培养条件:气温(25 ±1)℃，相对湿度45% ～75%，12 L:12 D 条件下培养.所用培养管105 ×27 mm2，玻璃厚1.5 mm.

1.2.2 白砂糖对雌果蝇寿命影响 收集在培养基Ⅰ生长8 h 新羽化未交配的雌果蝇，随机分管培养在培养基Ⅱ中，每组质量浓度重复5 管，每管30 只雌果蝇.每5 天更换1 次培养基，每天统计果蝇存活数、死亡数，直到全部死亡，计算平均寿命、平均最高寿命(后5 只死亡的平均时间)、半数死亡的时间、死亡曲线如图1. 分析结果选择1 号作为低糖组、3 号作为正常糖组、14 号作为高糖组进行下面的实验.

1.2.3 去氧孕烯炔雌醇片对果蝇寿命影响 收集在培养基Ⅰ生长8 h 内新羽化未交配的雌果蝇，随机分管培养在培养基Ⅲ中，每质量浓度组重复5 管，每管30 只雌果蝇. 每5 d 更换1 次培养基，每天统计果蝇存活数、死亡数，直到全部死亡，计算平均寿命、平均最高寿命(后5 只死亡的平均时间)、半数死亡的时间、死亡曲线结果如图2 ～5.

1.2. 4 统计方法 实验3 次重复，数据用SPSS 17.0 统计分析包处理，组间差异运用One-way ANOVA 方法进行分析，各组均数间差别比较采用LSD2 t检验，显著水平为P ＜0.05;极显著水平为P ＜0.01.

2 结果与分析

2.1 不同糖质量浓度对雌果蝇寿命的影响

与0 组(无糖组)比较(图1A)，糖质量浓度1 ～8 组、10 组的平均寿命都有极显著的延长，12 组有显著的延长，其他高糖组(11 组、13 ～16 组)均无显著性差异.平均最高寿命的结果显示，与0 组相比，1 ～6 组都极显著延长，14 ～16 组极显著缩短. 半数死亡时间结果显示，与0 组相比，除11 组无显著性的差异、13 号显著性延长外，其他各组都极显著延长.如图1B 所示，0 组果蝇的存活曲线位于坐标轴最内侧，最高寿命为35 d;果蝇生长15 d，0、11 ～16组的果蝇存活率开始急剧下降，而1 ～7 组在25 d才开始大量死亡.

图1 糖对雌果蝇寿命(A)及存活率(B)的影响Figure 1 Effects of sugar on the longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

与3 号组(正糖)相比较，其他各组的雌果蝇平均寿命都有极显著地缩短;各组的平均最高寿命(除1 号显著降低外)均呈现极显著降低;各组的半数死亡时间也都极显著的降低(如图1A).3 号组的存活曲线位于最外侧，最高寿命是55 d 左右，较其他各组，3 号组的存活率状态最好(如图1B).

2.2 不同去氧孕烯炔雌醇片质量浓度对雌果蝇寿命的影响

2.2.1 去氧孕烯炔雌醇片质量浓度对低糖模型的影响 在1 号组糖质量浓度(低糖)下，与0 号组(无药组)相比(图2A)，1 ～8 号的平均寿命都显著性延长，9 号和10 号差异不显著. 各组平均最高寿命都与0 号组差异不显著.1、5、6 号的半数死亡时间比0 号有显著性延长，其他组与0 号均无显著性差异. 去氧孕烯炔雌醇片质量浓度并未对黑腹雌果蝇存活率产生显著的影响(图2B)，各质量浓度组下的雌果蝇存活状态变化不大，但去氧孕烯炔雌醇片能够使雌果蝇的存活率略升高.

与5 号组相比，平均寿命除1 号和3 号无显著性差异外，其他各组都显著性缩短;与5 号给药组的平均最高寿命相比，0、8、9、10 号组均有显著性缩短;与5 号组的半数死亡时间相比，0、2、3、4 号有显著性的缩短，8、9、10 号极显著缩短(图2A).

图2 去氧孕烯炔雌醇片对低糖模型下果蝇寿命(A)及存活率(B)的影响Figure 2 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the low sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

2.2.2 去氧孕烯炔雌醇片质量浓度对正常糖模型的影响 在3 号糖质量浓度(正糖)模型下，1、4、5、7、9 号的平均寿命都比0 号组极显著的延长(图3A)，6、8 号有显著性的延长;各组的平均最高寿命与0 号组相比都有极显著的延长;与0 号组的半数死亡时间相比，1 号和10 号有极显著性缩短，2 号显著缩短，而5 号有极显著的延长.由图3B 可知，3、5号的存活曲线在外围，1、2、10 号的存活曲线在内侧，存活时间较短.

与5 号相比，各组的平均寿命都极显著缩短;8、9 号平均最高寿命与5 号比较无显著性变化，2号显著性延长，其他各组均极显著缩短;其他各组的半数死亡时间均比5 号组有极显著的缩短(如图3A).

图3 去氧孕烯炔雌醇片对正糖模型下果蝇寿命(A)及存活率(B)的影响Figure 3 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the normal sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

2.2.3 去氧孕烯炔雌醇片质量浓度对高糖模型的影响 如图4A 显示，14 号糖(高糖)模型下，去氧孕烯炔雌醇片与果蝇平均寿命的关系图呈现不是很规则的变化.对于平均寿命，与0 号相比，2、8、10 均有极显著差异，1、6、7 号均有显著性差异.平均最高寿命显示出与平均寿命相似的趋势，与0 号相比，1、2、6、8、10 号有显著性的缩短. 半数死亡时间显示，与0 号组相比，2、8 号有极显著性差异，1、10 号有显著性差异.如图4B 显示，0、4、5 号的存活曲线在外围，靠内的则是2 号药物质量浓度.

与5 号组相比，2、8、10 号的平均寿命均极显著缩短，4 号显著上升;与5 号的平均最高寿命相比，1号和2 号有显著性差异，8 号和10 号有极显著性的缩短;只有2 号和8 号的半数死亡时间，与5 号组有极显著性的差异(图4A).

而与4 号组(本组寿命最高)相比，1、2、6、7、8、10 号的平均寿命都有极显著性的降低，3、5 号有显著性的降低;1、8、10 号的平均最高寿命则均有极显著性降低，2、6 号则显著性降低;2、8 号的半数死亡时间有极显著性的缩短(如图4A).

2.2.4 3个模型下，去氧孕烯炔雌醇片质量浓度对果蝇最长寿命组影响的比较研究 如图5A 显示，与低糖(1 号糖模型下的5 号药质量浓度)比较，正糖(3 号糖模型下的5 号药质量浓度)的平均寿命、平均最高寿命、半数死亡时间都有显著性的延长;高糖(14 号糖模型下的4 号药质量浓度)3个指标都有极显著的下降;正常无药(3 号糖模型下的0 号药质量浓度)的平均寿命、半数死亡时间有显著性的缩短，平均最高寿命有极显著的缩短.图5B 的存活率的结果显示，与低糖模型的存活曲线相比，正常模型的存活曲线位于外围，高糖模型的存活曲线位于内侧，正常无药的存活曲线在35 天之前和低糖的很相似，但是35 天之后出现快速的缩短，最高寿命在40 天左右.

图4 去氧孕烯炔雌醇片对高糖模型下果蝇寿命(A)及存活率(B)的影响Figure 4 Effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the high sugar-dependent longevity (A)and the survival rate (B)of female D. melanogaster

与正常模型比较，低糖模型下的平均寿命、平均最高寿命、半数死亡时间都有显著性的缩短(图5A);高糖模型3个指标都有极显著的缩短;正常糖质量浓度下的无药组的半数死亡时间有显著性的缩短，平均寿命、平均最高寿命都有极显著的缩短. 图5B 的存活率的结果显示，与正常模型的存活曲线相比，低糖模型和正常无药交织位于内侧，高糖的位于最内侧，揭示存活率较低. 与高糖模型比较，正常无药的各指标都有极显著的延长. 图9B 的存活率的结果显示，与高糖模型比较，正常无药的存活曲线位于外侧(图5A).

3 讨论

动物的生长发育离不开摄食，Jiang 等［5］在酵母、Lakowski 等［6］在线虫、Chapman 等［7］在果蝇、Weindruchb 等［8］在啮齿动物乃至人类中已经证实减少营养的摄入可以延长寿命［9］. 果蝇生活在培养管中，能量的来源只有培养基，因此研究培养各成分对果蝇寿命的影响对饮食限制具有实际意义. 糖是各种果蝇培养基不变的成分，研究发现果蝇能量限制的倒“U”型曲线［10］，这种曲线会随着果蝇品系、食物来源、雌雄的差异等因素的变化而不同，本研究细化了糖质量浓度，拉大了糖质量浓度的范围，发现在40.5 mg/mL 糖浓度(3 号组)下雌性黑腹果蝇的寿命显著延长，与3 号糖组相比，无糖(0 号)组和高糖组(11 ～16 号)寿命显著降低，没有能量与能量过剩都会导致寿命的缩短.1 号属于低糖状态，低糖状态的雌性黑腹果蝇虽然没有3 号正常糖下的黑腹果蝇寿命长，但相对于高糖和无糖状态的黑腹果蝇寿命是显著性的延长，这就提示适度降低糖元素的摄入对寿命的影响是有益的，同样对于运动员也是成立的.但是长期低糖膳食是引发女运动员三联征的原因之一. 因此本文通过研究膳食和避孕药两者因素作用对雌性黑腹果蝇寿命的影响，使果蝇寿命状态最佳，为解决女运动员三联征问题提供线索.

图5 去氧孕烯炔雌醇片对3 种条件下最长寿命组果蝇寿命(A)及存活率(B)影响Figure 5 The effects of Desogestrel and Ethinylestradiol Tablets on the longevity (A)and the survival rate (B)of three kinds of female D. melanogaster

当女性激素增多时，就会通过丘脑下部抑制或减少脑垂体分泌促性腺激素. 一旦促性腺激素被抑制或减少，卵巢里的卵泡就不会发育成熟和排卵.去氧孕烯炔雌醇片是一类短效口服避孕药，通过去氧孕烯与炔雌醇抑制垂体－性腺轴来抑制排卵，另外还能增加宫颈粘液的粘稠度，达到避孕的效果.范光升等研究短效口服避孕药是女性常用避孕药，使生理周期达到一个新的周期，是有效而可逆的避孕方法之一［11］.避孕药中含有雌激素，女性随着年龄的增长体内雌激素水平会显著下降，长期服用避孕药能起到调节体内激素平衡的作用，对改善痛经、痤疮，光滑皮肤有帮助［12］. Philip C Hannaford 调查超过46 000 名英国女性分析了口服避孕药使用情况与病死和暴力伤害致死之间的关系，结果发现在人生某些阶段曾服用避孕药的女性，因疾病死亡的风险较低［13］.但近几年关于长期口服避孕药危害的研究也在同样受到关注，结果发现对糖脂代谢及血液学确实存在影响，但对免疫系统和遗传基因影响不大，未有充分证据说明对肿瘤发生的促进作用［14］.我们的研究发现在低糖模型下(13.5 mg/mL)，0.25 mg/mL 的避孕药可以显著地延长果蝇寿命，而无避孕药和高避孕药质量浓度都不利于雌性黑腹果蝇的生长;正常糖模型下(40.5 mg/mL)，避孕药也是在0.25 mg/mL 质量浓度下的雌性果蝇寿命状况最好，显著性相比低糖状态更为明显;然而在高糖模型下，雌性果蝇的寿命随避孕药质量浓度变化不再出现明显的倒U 型曲线，寿命最高点的质量浓度出现在4号(0.20 mg/mL)，无避孕药组的寿命较高，高质量浓度组也未出现显著性的下降. 提示运动员在服用避孕药或激素类药物的同时要注意饮食习惯的影响，低糖或者正常糖摄入会使避孕药的作用发生显著的变化.

4 结论

(1)在糖质量浓度(40.5 mg/mL)(3 号组)下雌性黑腹果蝇的寿命显著延长，与3 号糖组(正糖)相比，无糖(0 号)组和高糖组(11 ～16 号)寿命显著降低，没有能量与能量过剩都会导致寿命的缩短.

(2)由不同糖模型状态下避孕药对雌性黑腹果蝇寿命影响的结果提示运动员在服用避孕药或激素类药物的同时要注意饮食习惯的影响，低糖或者正常糖摄入会使避孕药的作用发生显著的变化.

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