亚慢性镉染毒模型中hMSH2基因mRNA的表达变化

黄钦海，周志衡，雷毅雄，刘 群

(广州医科大学公共卫生学院，广东广州 510182)

镉(Cadmium，Cd)是已被确认的人类致癌物。镉及其化合物是常见的工业毒物和环境污染物，长期暴露可引起肾脏、肝脏、前列腺、睾丸和肺脏等器官功能障碍，甚至导致肿瘤的发生。镉的致癌作用机制十分复杂，尽管人们做了大量的研究，但至今未能完全阐明其分子致癌机制。研究显示，氯化镉可导致DNA损伤和引起损伤修复障碍［1］。本研究采用实时荧光PCR(QPCR)法分析在亚慢性氯化镉(CdCl2)染毒大鼠模型及其诱发人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化模型细胞中hMSH2 mRNA表达的规律，探讨镉的致癌机制。

1 材料与方法

1.1 染毒模型构建

1.1.1 亚慢性氯化镉染毒大鼠模型构建(动物模型) 在急性毒性试验的基础上，用SPF级别SD大鼠32只按体重随机分4组，3个CdCl2染毒组(高剂量 1.225 mg·kg－1、中剂量 0.612 mg·kg－1和低剂量 0.306 mg·kg－1)和 1个生理盐水对照组(0.9%NaCl)，每组8只大鼠，雌雄各半，腹腔注射，每天1次，每周5 d，连续14周。

1.1.2 氯化镉诱导细胞恶性转化模型构建(细胞模型) 本课题组早期建立的氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮(16HBE)细胞恶性转化模型［2］:以MEM培养液［含10%(V/V)小牛血清］培养16HBE系细胞，于指数生长期加入终浓度15μmol·L－1的CdCl2，作用24 h，每隔12 d处理1次，共处理 10次，细胞培养至第35代，经细胞形态学观察，软琼脂集落分析及裸鼠成瘤试验，证实CdCl2具有恶性转化16HBE的作用。

1.2 细胞培养 16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系第4、14、35代细胞、成瘤细胞(镉恶性转化16HBE 35代细胞接种裸鼠成瘤，分别以同代的无镉处理的16HBE细胞(无镉处理第4、14、35代细胞)为对照细胞，用含小牛血清10%(V/V)的MEM培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度环境的培养箱中培养。

1.3 QRT-PCR技术检测hMSH2的mRNA表达

1.3.1 引物设计与合成 引物参照文献设计，由上海生工公司合成，其序列如下:大鼠hMSH2上游引物为 5'－ CAGCAGAGGTGTCCATTGTG －3'，下游引物为5'－GCAGTTTCCAGCA TTTCAGC －3'，大鼠内参GAPDH上游引物为5'－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3'，下游引物为:5'－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3'。细胞模型hMSH2上游引物为 5'－CATCCAGGCATGCTTGTGTTGA －3'，下游引物为5'－GCAGTCCACAATGGACACTTC－3'，内参β－Actin上游引物为5'－ACAGAG CCTCGCCTTTGCCGAT－3'，下游引物 5'－CTTGCACATGCCGGAGCCGTT －3'。

1.3.2 总RNA提取与逆转录 于－80℃ 冰箱取出亚慢性氯化镉染毒大鼠模型肺脏、肝脏和肾脏组织，液氮下研磨，移至1.5 mL无RNA酶EP管中，按Trizol试剂盒(GIBCO BRC)说明书的步骤提取总RNA(用紫外分光核酸蛋白分析仪测RNA的纯度和浓度，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性)。取对数生长期各组氯化镉恶性转化模型细胞，每管加1 mL Trizol后按上面相同步骤提取和鉴定总RNA。按promega逆转录试剂盒(A5001)说明书方法逆转录总RNA为cDNA。cDNA于－20℃保存备用。

1.3.3 检测hMSH2的mRNA表达 按promega GoTaq®QPCR master mix(A6001)试剂盒(说明书操作步骤，在ABI 7900 Real Time PCR反应仪器上进行PCR扩增，扩增条件:95℃10 min预变性;95℃15 s，60℃ 60 s共40个循环。根据△Ct=样品Ct均值－内参照Ct均值计算所得2－△△Ct即代表被检样品hMSH2基因mRNA的含量。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0软件处理系统对结果进行统计学分析。hMSH2 mRNA的相对含量以±s表示，均通过正态性检验。多组间的比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD或SNK法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 亚慢性CdCl2染毒大鼠模型中hMSH2 mRNA表达水平 结果显示，与对照组(未染毒组)相比，肺脏和肾脏组织hMSH2 mRNA表达水平均存在显著降低，高剂量组降低明显，且呈随染毒剂量升高而降低趋势(P＜0.05)。肝脏组织hMSH2 mRNA表达水平也呈降低趋势，但未见显著差异，见表1。

表1 亚慢性Cd Cl2染毒大鼠组织hMSH2 mRNA相对表达量(±s)

表1 亚慢性Cd Cl2染毒大鼠组织hMSH2 mRNA相对表达量(±s)

注:肺 F=5.572，肾 F=3.875，均 P ＜0.05;* 表示与对照组比较，P ＜0.05(LSD 检验)。

组别 动物/只 肺脏 肝脏 肾脏对照组8 1.06 ±0.39 1.04 ±0.36 1.11 ±0.52低剂量组 8 0.79 ±0.28* 0.95 ±0.46 0.97 ±0.14中剂量组 8 0.62 ±0.11* 0.85 ±0.30 0.81 ±0.27高剂量组 8 0.61 ±0.12* 0.66 ±0.13 0.60 ±0.20*

2.2 16HBE细胞Cd Cl2恶性转化细胞模型中hMSH2 mRNA表达水平 结果表明，与对照组(未染毒组)16HBE细胞相比，恶性转化组(染毒组)细胞hMSH2 mRNA表达水平显著性降低，呈随恶性转化代数的增加而降低趋势，第35代细胞和成瘤细胞显著下降(P＜0.05)。见图1。

3 讨论

DNA 错配修复(mismatch repair gene，MMR)基因由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成，具有修复DNA碱基错配，防止基因突变，维持基因稳定的功能。一旦MMR基因产生突变和遗传多态性，导致其表达和功能改变，降低甚至失去正常的错配修复能力，增加肿瘤发生的风险［3－6］。MMR包括 hMLH1、hMSH2、hPMS1、hPMS2、hMSH3、hMSH6等，近年来研究发现90%以上的突变发生于 hMLH1 和 hMSH2［7－9］，进而破坏细胞基因组的稳定性，引起细胞异常增殖及分化，形成肿瘤发生发展的基础因素［10］。研究表明hMSH2基因可通过诱导细胞凋亡发挥肿瘤抑制功能［11］。因此，hMSH2基因的正常表达对维持其MMR功能有着重要意义，是维持基因稳定性的分子基础。

镉已被确定为人类I类致癌物，其分子致癌机制十分复杂，至今未能充分阐明。hMSH2基因在镉致机体组织损伤及致癌过程中的作用甚少报道，其作用机制至今未被完全阐明。肿瘤组织往往存在相关基因的表达异常［12］，研究基因表达变化对寻找肿瘤标志物和了解致癌机制具有重要意义。本研究利用CdCl2染毒模型，在大鼠和人16HBE细胞中分别研究hMSH2基因表达水平的变化。研究结果显示，在亚慢性CdCl2染毒大鼠模型中，大鼠肺和肾脏组织hMSH2基因表达水平均呈随染毒剂量的增加而下降趋势，高剂量组下降尤为明显(均P＜0.05);细胞CdCl2染毒恶性转化模型中，随着转化代数的增加，hMSH2基因表达水平也呈现降低趋势，到第35代和成瘤细胞显著降低(P＜0.05)。说明CdCl2染毒模型中组织和细胞hMSH2 mRNA呈异常表达，提示hMSH2基因异常表达可能与镉的致癌作用有关。其作用机制尚未明确，有待进一步研究。

［1］Candeias S，Pons B，Viau M，et al.Direct inhibition of excision/synthesis DNA repair activities by cadmium:analysis on dedicated biochips［J］.Mutat Res，2010，694(1):53 －59.

［2］Lei YX，Wei L，Wang M，et al.Malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor during human bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride［J］.Biomed Environ Sci，2008，21(4):332 －338.

［3］Wang LE，Hu Z，Sturgis EM，et al.Reduced DNA repair capacity for removing tobacco carcinogen－induced DNA adducts contributes to risk of head and neck cancer but not tumor characteristics［J］.Clin Cancer Res，2010，16(2):764 －774.

［4］Martin SA，Mccabe N，Mullarkey M，et al.DNA polymerases as potential therapeutic targets for cancers deficient in the DNA mismatch repair proteins MSH2or MLH1［J］.Cancer Cell，2010，17(3):235－248.

［5］Limburg PJ，Harmsen WS，Chen HH.DNA mismatch repair gene alterations in a population based sample of young onset colorectal cancer patients.clinical gastroenterology and hepatology［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2011，9(6):497 －520.

［6］Lord CJ，Ashworth A.The DNA damage response and cancer therapy［J］.Nature，2012，481(7381):287 －294.

［7］Lynch PM.The hMSH2 and hMLH1 genes in hereditary nonpolyposis colorectal cancer［J］.Surg Oncol Clin N Am，2009，18(4):611－624.

［8］Lee HJ，Jang YJ，Lee EJ，et al.The significance of mismatch repair genes in gastric cancer［J］.Cancer Res Ther，2013，9(1):80 －83.

［9］Vergouwe F，Boutall A，Stupart D，et al.Mismatch repair deficiency in colorectal cancer patients in a low － incidence area［J］.SAfr J Surg，2013，51(1):16 －21.

［10］宋颖韬，周晓燕，孙长生，等.错配修复蛋白hMSH2、hMLH1在涎腺粘液表皮样癌中的表达［J］.现代生物医学进展，2014，14(10):1839－1843.

［11］侯睿智，安治国，魏 君，等.大肠癌易感基因hMLH1、hMSH2的筛查［J］.中国实验诊断学，2012，16(1):49 －51.

［12］魏 岩，吴 强.Twist－2在宫颈癌中的表达及意义［J］.安徽医药，2014，18(10):1913 －1915.