29个Y-STR基因座复合扩增体系的建立

王新杰，罗莉静，黄磊，许欣

（1.潍坊市公安局，山东潍坊 261061；2.山东省公安厅，山东济南 250001）

29个Y-STR基因座复合扩增体系的建立

王新杰1，罗莉静1，黄磊2，许欣1

（1.潍坊市公安局，山东潍坊 261061；2.山东省公安厅，山东济南 250001）

目的建立29个Y-STR基因座的复合扩增体系，进行遗传多态性调查，并评价其法医学应用价值。方法采用五色荧光标记技术，对29个Y-STR基因座（DYS456、DYS389Ⅰ、DYS437、DYS447、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS522、DYS460、DYS458、DYS622、DYS390、DYS392、DYS448、DYS449、DYS391、Y-GATA-H4、DYS388、DYS19、DYS385a/b、DYS527a/b、DYS393、DYS459a/b、DYS635、DYS439、DYS570和DYS627）进行复合扩增和毛细管电泳检测。调查山东汉族2000名无关男性个体29个Y-STR基因座的遗传多态性数据，并对系统性能进行检测。结果本方法同时检测29个Y-STR基因座，在2000名个体中共检出1981种单倍型，基因多样性在0.3700～0.9654。方法特异性好，分型结果准确稳定，灵敏度达0.05ng，实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论29个Y-STR基因座复合扩增检测法可以用于实际案例检验，调查所获数据对建立Y-STR数据库的相关研究和应用具有重要意义。

法医遗传学；多态现象，遗传；Y染色体；短串联重复序列

Y染色体STR单倍型父系遗传的特点在诸如父系家族的亲权鉴定、混有女性或多人份男性混合斑中男性个体分型以及追溯父系迁移历史等方面具有独特的应用价值[1]。由于Y-STR基因座呈单倍型遗传，其识别能力通常低于同等数目常染色体STR基因座，不能用于个体同一认定，且Y-STR基因座的多态性在不同人群的差异也远远高于常染色体基因座。因此，为获得较高的系统鉴别能力，应尽量选择多态性高的基因座，并尽可能在系统中纳入更多的STR基因座。本研究采用五色荧光标记复合扩增技术对29个Y-STR基因座进行检测，并调查山东地区汉族人群的遗传多态性，以评价其在法医学常见物证检材中应用的价值，旨在为法庭科学DNA分析提供一种新方法，并为相关分析和研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样本

遗传多态性调查样本2 000份男性无关个体血样为实验室日常积累。种属特异性测试样本：黑猩猩、猕猴、狒狒血样取自潍坊市动物园，猪、牛、驴、狗、猫、鱼购于市场。男性特异性测试样本：男性DNA标准品

007和女性DNA标准品9947A，按照1∶1 000的比例混合；20份女性无关个体血样来源于日常积累。实际案件样本：本实验室日常积累的案件检材，包括血斑、精液（阴道液）混合斑、汗液斑、唾液斑、肋软骨、肌肉组织、骨骼及毛发。

1.2 复合扩增体系的建立

1.2.1 基因座选择及引物设计

考虑到不同试剂盒的兼容性，本研究首先选择AmpF詛STR誖Yfiler誖PCR扩增试剂盒（简称Yfiler试剂盒）、PowerPlex誖Y23试剂盒和AGCU 24Y荧光检测试剂盒（美国AB公司）共同包含的17个Y-STR基因座，在此基础上又增加了12个Y-STR基因座，以获得更高的系统鉴定能力。29个Y-STR基因座碱基序列查自基因组数据库及相关文献[1-4]。

设定所选目标基因座的片段大小范围后，在目标重复序列两侧，用Primer Express誖Software Version 3.0设计引物，对获得的单基因座引物的扩增条件先进行优化，必要时重新设计引物，直至得到特异性扩增产物。

在成功建立单基因座扩增条件的基础上，通过反复实验确定复合扩增中的各个参数，使各基因座扩增产物基本达到平衡、特异的要求，最终建立多重复合扩增体系。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和标记，29个基因座的相关信息见表1。

表1 29个基因座的相关信息

1.2.2 PCR扩增条件

PCR反应总体积为10 μL，内含DNA模板0.5～ 2ng，dNTP 250 μmol/L，MgCl22.0 mmol/L，1×缓冲液，金牌Taq酶2U，纯水补至10μL，引物及浓度（μmol/L）分别为DYS456（0.38）、DYS389Ⅰ/Ⅱ（0.54）、DYS437（0.24）、DYS447（1.11）、DYS438（0.91）、DYS522（1.21）、DYS460（0.25）、DYS458（0.38）、DYS622（0.25）、DYS390（0.35）、DYS392（7.35）、DYS448（0.30）、DYS449（0.83）、DYS391（0.30）、Y-GATA-H4（0.89）、DYS388（2.21）、DYS19（5.43）、DYS385a/b（1.56）、DYS527a/b（0.66）、DYS393（0.96）、DYS459a/b（1.71）、DYS635（1.21）、DYS439（1.01）、DYS570（1.91）和DYS627（8.05）。热循环参数：95℃11 min；94℃1 min，59℃1 min，72℃1min，28个循环；60℃60min，4℃保温。

1.2.3 电泳及Y-STR分型

取PCR产物1μL与9μL去离子甲酰胺、0.2μL

LIZ-500混匀，95℃3 min后立即冰浴3 min。使用3130XL型遗传分析仪（美国AB公司）以3kV 10s进行电泳分离。GeneMapper誖ID v3.2软件进行分析判型。

1.3 扩增体系技术指标验证

一致性验证：2 000份无关男性血样按本研究方法进行扩增及分型检测，其Y-STR分型结果与Yfiler试剂盒分型结果进行比较。

灵敏度验证：取男性DNA标准品007稀释至2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.05、0.025ng/μL，按本方法平行重复检测3次。

种属特异性验证：取人源性和非人源性DNA（黑猩猩、猕猴、狒狒、猪、牛、驴、狗、猫、鱼）按本方法检测Y-STR基因座。

男性特异性验证：取20份女性DNA样本；0.1ng标准品007和100 ng标准品9947A以1∶1 000比例混合后；分别按本方法检测分析。

案件检材适应性验证：取案件检材血斑、精液（阴道液）混合斑、汗斑、唾液斑、肋软骨、肌肉、骨骼及毛根，提取DNA后采用本方法检测。

1.4 统计学分析

应用直接计数法计算29个Y-STR基因座等位基因频率和单倍型频率。基因多样性（GD）或单倍型多样性（HD）用公式GD（HD）=n（1-∑Pi2）/（n-1）计算，其中n为样本数，Pi为等位基因频率或单倍型频率[2]。

2 结果与讨论

2.1 复合扩增系统评价

采用本研究方法，29个Y-STR基因座均得到有效扩增，采用0.5ng DNA模板进行扩增，平均峰高约2000RFU，且各基因座间扩增产物峰高均衡，峰型对称尖锐、无钉子峰和其他干扰峰，基线平（图1）。将各个基因座上含不同等位基因的样品单个进行扩增，扩增产物按比例混合，平衡后再将等位基因混合物稀释1000～10000倍后再次扩增，所得产物作为该基因座的等位基因分型标准物（图2）。2000份无关男性个体血样经本研究方法检测，结果与Yfiler试剂盒相同基因座的分型结果均完全一致，说明本研究方法具有较好的准确性和一致性。

本研究最佳模板量在0.125～1.0ng/μL，模板量低至0.05ng/μL仍可获得完整STR分型结果，但峰值可小于80RFU。模板量在1.0～2.0ng/μL时，仍可获得较好的分型结果，且未出现拔起峰等杂峰。

用本研究方法对黑猩猩、猕猴、狒狒、猪、牛、驴、狗、猫、鱼9种动物样本进行检验，结果黑猩猩因与人DNA同源性高达98%[5]，共检测出9个扩增片段，但其中4个峰位于基因座等位基因bin上，4个位于bin中间，1个峰位于两个基因座之间，与人DNA检测结果有明显区别，故不影响对人样本的判型，但如果发现混合分型时应注意鉴别[6]。狒狒、猕猴和非灵长类动物的检测结果均为阴性。男性DNA标准品007和女性DNA标准品9947A按1∶1 000的比例混合后用本方法检测，结果男性样本可准确分型，未发现女性样本干扰。此外，曾有报道[7]在DYS391和DYS393基因座上有个别女性样本出现扩增产物，而20例女性样本均未出现扩增产物。此外，对血斑、精液（阴道液）混合斑、汗液斑、唾液斑、肋软骨、肌肉组织、骨骼及毛根等样本，经磁珠法提取DNA后采用本研究方法扩增检测，均获得29个基因座的分型，结果与Yfiler相同基因座的结果一致。

图1 29个Y-STR基因座的复合扩增分型图谱

图2 等位基因标准物分型图谱

2.2 29 个Y-STR基因座遗传多态性

2000 名山东汉族男性无关个体29个Y-STR基因座检出等位基因数分别为DYS456（8）、DYS389Ⅰ（7）、DYS437（8）、DYS447（12）、DYS389Ⅱ（12）、DYS438（6）、DYS522（7）、DYS460（6）、DYS458（14）、DYS622（11）、DYS390（9）、DYS392（8）、DYS448（10）、DYS449（19）、DYS391（6）、Y-GATA-H4（7）、DYS388（8）、DYS19（9）、DYS385a/b（18）、DYS527a/b（18）、DYS393（7）、DYS459a/b（5）、DYS635（8）、DYS439（8）、DYS570（10）和DYS627（19），各等位基因频率及GD值见表2～3，除DYS391、DYS438外，其余基因座的GD值均大于0.5。

表2 29个Y-STR基因座的等位基因频率（n=2000）

续表2

表2 29个Y-STR基因座的基因多样性（n=2000）

2000名个体样本使用本方法共检出1981种单倍型，其中19种单倍型出现2次。Y染色体单倍型多样性与个体识别能力、非父排除率数值相同[3]，而单倍型多样性值越接近1，家系鉴别能力越强。本方法调查2000名个体的单倍型多样性值为0.999 990 495，说明具有很强的家系鉴别能力，对案件鉴定、Y-STR数据库建设、遗传关系的研究有重要意义。与本研究中单独采用Yfiler试剂盒相比较，Yfiler试剂盒检出1950种单倍型，其中50种单倍型出现2次，单倍型多样性值为0.999974987，本方法的家系鉴别能力明显增强。

综上，本研究建立的29个Y-STR基因座的复合扩增体系与其他方法相比具有较大的兼容性、更高的单倍型多样性，在法医学应用、遗传学研究中有较大的应用潜力。

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Establishing a 29 Y-STR Loci Multiplex PCR System

WANG Xin-jie1,LUO Li-jing1,HUANG Lei2,XU Xin1
（1.Weifang Public Security Bureau,Weifang 261061,China;2.Shandong Province Public Security Department,Jinan 250001,China）

Objective To establish a 29 Y-STR loci multiplex PCR system for investigating the genetic polymorphisms and to assess its application value in forensic science.Methods A multiplex PCR system was established using a five color fluorescence labeling 29 Y-STR loci（DYS456,DYS389Ⅰ,DYS437, DYS447,DYS389Ⅱ,DYS438,DYS522,DYS460,DYS458,DYS622,DYS390,DYS392,DYS448,DYS449, DYS391,Y-GATA-H4,DYS388,DYS19,DYS385a/b,DYS527a/b,DYS393,DYS459a/b,DYS635,DYS439, DYS570 and DYS627）for multiple amplification and capillary electrophoresis.And its applicability was validated with genetic polymorphism data of 29 Y-STR of unrelated 2 000 male samples in Shandong Han population.Results A total of 1 981 different haplotypes of 2000 individuals showed genotype diversity between 0.3700 and 0.9654.The system provided stable and accurate typing with high sensitivity of 0.05 ng.It satisfied the needs of variety of routine biological samples.Conclusion The 29 Y-STR loci multiplex PCR system could be applied for actual cases and establishment of Y-STR database.In addition,it has great significance in forensic science practices and related research.

forensic genetics;polymorphism,genetic;Y Chromosome;short tandem repeat sequences

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.011

1004-5619（2015）06-0456-06

2014-09-24）

（本文编辑：李成涛）（

2015-08-25）

王新杰（1973—），男，副主任法医师，主要从事法医物证学检验；E-mail：wfxjfy@aliyun.com