Ion Torrent PGMTM系统检测孕妇血浆中胎儿游离DNA

刘亚楠，赵雪莹，平原，徐庆文，黄江平，邹凯南，周怀谷

（1.上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海 200083；2.上海市刑事科学技术研究院，上海 200083）

Ion Torrent PGMTM系统检测孕妇血浆中胎儿游离DNA

刘亚楠1，赵雪莹2，平原1，徐庆文1，黄江平1，邹凯南1，周怀谷1

（1.上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室上海市现场物证重点实验室，上海 200083；2.上海市刑事科学技术研究院，上海 200083）

目的探讨Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血血浆中胎儿游离DNA的Y-STR检测的可行性。方法采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）的无关孕妇外周血血浆，提取胎儿游离DNA，对DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635共7个基因座进行复合扩增，在Ion Torrent PGMTM系统进行Y-STR测序分析和毛细管电泳分析，并将两者结果进行比较。结果在分娩男性胎儿的孕晚期及中期孕妇血浆中均检测到Y-STR片段，测序检测得出的基因座比毛细管电泳检测得出的多，且与分娩胎儿的Y-STR基因型相一致。结论Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血血浆胎儿游离DNA的Y-STR检测，具有高灵敏度、高通量的特点，且有较好的法医学应用价值。

法医遗传学；Y染色体；孕妇；胎儿；短串联重复序列；Ion Torrent PGMTM系统

在各类刑事案件中，会遇到因为强奸致孕而涉及需要在妊娠期间进行亲子鉴定的案件。在实际侦查办案中，一方面，被害人希望及时终止妊娠，另一方面，为了确保获得胎儿的遗传信息以便确认犯罪嫌疑人，侦查部门希望受害者能在孕龄12周后流产取证。

自上世纪70年代第一代测序技术的问世，DNA测序技术发展突飞猛进，到2010年美国Thermo Fisher公司推出了一款个人化操作基因组测序仪——Ion Torrent Personal Genomic MachineTM（Ion Torrent PGMTM），该测序仪是基于半导体芯片的新一代测序技术，单次反应可检测几十至几百万条DNA分子，具有反应速度快、操作简便、数据质量较高等优点。本研究旨在利用Ion Torrent PGMTM测序系统，对孕晚期和孕中期孕妇外周血中胎儿游离DNA的Y-STR基因型进行检测，比较

基于传统毛细管电泳的荧光检测方法和新一代测序方法在无创性产前亲子鉴定中的优劣，探索孕妇外周血在强奸致孕案件中的应用价值，建立孕妇外周血胎儿游离DNA的Ion Torrent检测方法，为强奸致孕案件中亲子鉴定技术的发展提供基础性研究和新手段。

1 材料与方法

1.1 样本来源

按照知情同意原则，采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）孕妇外周血样本各2mL（EDTA抗凝），并采集其分娩后胎儿的脐带组织作为对照。

1.2 DNA提取及分组

实验组：在4℃条件下，取8例孕晚期孕妇和8例孕中期孕妇外周血样本各2mL，1600×g离心10min，吸取600μL上清液。在4℃条件下，将吸取的600μL上清液，16000×g离心10min，取上清液。应用血浆、血清游离核酸提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取孕妇外周血游离DNA。

对照组：取8例孕晚期和8例孕中期孕妇分娩后胎儿脐带组织各1cm×1cm。应用EZ1 DNA Investigator提取试剂盒（德国QIAGEN公司）提取脐带组织DNA。

1.3 聚合酶链反应

1.3.1 引物

选取Y-STR基因座DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635，以Primer 3 Plus软件针对每一基因座设计引物。引物序列见表1。

表1 Y染色体STR基因座的引物序列

1.3.2 PCR扩增

实验组：应用GlobalFilerTM试剂盒（美国Thermo Fisher公司）对8例孕晚期和8例孕中期孕妇外周血DNA样本进行复合扩增，反应体系均为15 μL，引物混合液0.17mol/L，反应混合液20μL。反应条件均为：95℃1 min；94℃3 s，60℃30 s，共32个循环；60℃8min，4℃保存。

对照组：应用Yfiler誖PCR扩增试剂盒（美国Thermo Fisher公司）对8例孕晚期和8例孕中期孕妇分娩后胎儿脐带组织DNA样本进行复合扩增，反应体系为25 μL，反应液10 μL，引物混合液5 μL，金牌酶0.5μL。反应条件：95℃11min；94℃1min，61℃1min，72℃1 min，共35个循环；60℃80 min，4℃保存。

1.4 文库构建

应用Qubit dsDNA HS Assay试剂盒（美国Thermo Fisher公司）在Qubit 2.0定量平台（美国Thermo Fisher公司）测定PCR产物浓度。采用Ion Plus Fragment Library试剂盒（美国Thermo Fisher公司）和Ion Xpress Barcode Adapter试剂盒（美国Thermo Fisher公司），在片段两端分别连接有标签序列（Barcode）的接头和测序接头构建文库，并纯化。

1.5 模板制备和测序

模板制备采用Ion PGMTMTemplate OT2 400试剂盒（美国Thermo Fisher公司），利用Ion OneTouchTM2.0系统进行乳浊液PCR以及产物富集。

测序采用Ion PGMTMSequencing 400试剂盒（美国Thermo Fisher公司），选择Ion 316 v2芯片，利用Ion Torrent PGMTM系统完成测序反应。

1.6 数据分析

测序数据使用Ion Torrent PGMTM系统配套分析设备Torrent Suite（4.0）进行分析。根据Barcode和引物序列对有效测序片段进行拆分及序列比对，通过聚类分析读取STR核心序列，STR基因型的命名参考STRBase[1]。毛细管电泳数据采用GeneMapper软件进行分析。本研究对实验组的孕妇外周血样本和对照组的胎儿脐带组织样本分别读取Y-STR核心序列并进行一一比对，以此检验Ion Torrent PGMTM系统用于孕妇外周血胎儿游离DNA Y-STR检测的可靠性。

2 结果与讨论

2.1 测序结果

本研究采用Ion Torrent PGMTM系统对孕中期和孕晚期样本进行测序，以其中一块Ion 316 v2芯片为例，结果如图1。芯片中有效区域达87%，其中连接文库为100%。除去28%的多克隆、35%的低质量文库和0%的测试片段，最终有效文库为47%，共2.5×106个读取片段，片段平均读长为156bp。产生的原始测序数据总量为378Mb。

图1 Ion Torrent PGMTM系统的测序结果

2.2 测序结果遗传学分析

8 名孕晚期孕妇和8名孕中期孕妇外周血血浆样本中，8例孕晚期和5例孕中期均检测出Y-STR等位基因，3例孕中期未检测出Y-STR等位基因。胎儿出生后证实8例孕晚期孕妇的胎儿均为男胎，8例孕中期孕妇的胎儿中5例为男胎，3例为女胎（表2）。

7 个基因座扩增产物长度均为220 bp以下，以DYS393基因座扩增产物的片段长度最小（约117bp），扩增效果好，检出率最高；以DYS437基因座产物的片段长度最大（约213bp），扩增效果好，检出率较低。据文献[2]报道，分娩男婴的孕妇外周血血浆样本中游离DNA含量在妊娠中期平均为36基因组当量/mL，在妊娠晚期为176基因组当量/mL。受胎儿结构完整性的限制，即当胎儿细胞经过胎盘屏障，细胞整体结构被母体的免疫系统所破坏，胎儿的有核红细胞破裂，DNA进入孕妇血液循环[3]，这可能是片段大的等位基因扩增效果差的原因之一。

本实验选取了7个Y-STR基因座进行复合扩增，扩增产物应用Ion Torrent PGMTM系统进行测序，并选取孕妇分娩后男性胎儿脐带组织DNA作为对照，同时应用Yfiler誖PCR扩增试剂盒对上述样本进行Y-STR的毛细管电泳荧光检测分析以验证孕妇外周血胎儿游离DNA分型结果的准确性。孕晚期和孕中期孕妇外周血的游离DNA在Ion Torrent PGMTM系统测序方法检测出等位基因的基因座比毛细管电泳荧光检测出的基因座多，说明Ion Torrent PGMTM系统灵敏度要远远高于荧光检测平台。对比孕晚期和孕中期，发现孕晚期检测出的基因座比孕中期多（表3），这可能与孕妇外周血的胎儿游离DNA量随着孕期延长而增加有关[4]。表3中，孕晚期检出的7个Y-STR基因座，毛细管电泳检测到的Y-STR样本数量为0～3个，平均（1.57±0.98）个，测序法检测到的Y-STR样本数量为7～8个，平均（7.14±0.69）个，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。孕中期检出的7个Y-STR基因座，毛细管电泳检测到的Y-STR样本数量为0～1个，平均（0.43±0.54）个，测序法检测到的Y-STR样本数量为2～5，平均（4.43±1.13）个，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 孕中期孕妇外周血血浆和分娩后脐带组织Ion Torrent PGMTM测序等位基因分型结果

表3 孕中、晚期孕妇外周血血浆和脐带组织中Y-STR的毛细管电泳和Ion Torrent PGMTM测序检出结果比较

2.3 Y-STR的等位基因分型

应用Ion Torrent PGMTM系统测序得到Y分型与男性胎儿检测分型相一致，准确性达到100%，但是存在个别样本位点少量缺失的现象，这可能与孕妇外周血血浆中的游离DNA量极少，且游离DNA完整性受限制有关[3]。

对Y-STR的毛细管电泳检测分析结果显示，每例样本只能获得0～3个基因座的等位基因，无法明确判定基因型。而测序结果显示，7个基因座中共检测出21个等位基因，具体序列见表4。

结果显示，采用Ion Torrent PGMTM测序法进行Y-STR检测，能够同时获取Y-STR长度多态性及序列多态性信息，极大地提高其应用于亲子鉴定的识别率。

表4 Ion Torrent PGMTM测序检测Y-STR基因座的等位基因分型结果

2.4 结论

本研究建立了Ion Torrent PGMTM系统对孕妇外周血中的游离DNA进行Y-STR测序检测的方法，可以通过Ion Torrent PGMTM系统尽早检测被害人外周血游离DNA的Y-STR基因分型，为确定犯罪嫌疑人提供佐证。我们将进一步对孕妇外周血游离胎儿DNA常染色体STR基因座的检测进行研究，为其在法庭科学中的应用提供更大价值。

[1]Ruitberg CM，Reeder DJ，Butler JM.STRBase：a short tandem repeat DNA database for the human identity testing community[J].Nucleic Acids Res，2001，29（1）：320-322.

[2]Levine RJ，Qian C，Leshane ES，et al.Two-stage elevation of cell-free fetal DNA in maternal sera before onset of preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol，2004，190（3）：707-713.

[3]Pertl B，Bianchi DW.Fetal DNA in maternal plasma：emerging clinical applications[J].Obstet Gynecol，2001，98（3）：483-490.

[4]Lo YM，Zhang J，Leung TN，et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma[J].Am J Hum Genet，1999，64（1）：218-224.

Application of Ion Torrent PGMTMSystem in Detection of Fetal DNA in Maternal Plasma

LIU Ya-nan1,ZHAO Xue-ying2,PING Yuan1,XU Qing-wen1,HUANG Jiang-ping1,ZOU Kai-nan1,ZHOU Huai-gu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence,Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology,Ministry of Public Security,Institute of Forensic Science,Shanghai Public Security Bureau, Shanghai 200083,China;2.Shanghai Research Institute of Criminal Science and Technology,Shanghai 200083,China）

Objective To explore the feasibility of detecting of Y-STR of fetal DNA in maternal plasma using Ion Torrent PGMTMSystem.Methods A total of 16 fetal DNA samples from maternal plasmas（8 cases from 38 weeks gestational age and 8 ones from 12 weeks）were prepared and a multiplex assay with 7 STR loci（DYS390,DYS391,DYS393,DYS438,DYS437,DYS456,DYS635）was designed for multiplex-PCR amplification.Using Ion Torrent PGMTMSystem,the results of Y-STR sequences and capillary electrophoresis were obtained and compared.Results Y-STR specific alleles were detected in the maternal plasma of all the pregnant women having male babies of second and third trimester,which were higher than that detected by capillary electrophoresis.Consistent Y-STR genotypes were observed between fetal DNA from maternal plasma and genomic DNA from the newborn babies.Conclusion Based on Ion Torrent PGMTMSystem,the prenatal Y-STR detection method may provide a high-sensitive and high-throughput choice for prenatal STR detection in forensic testing.

forensic genetics;Y chromosome;pregnant women;fetus;short tandem repeat sequences; Ion Torrent PGMTMSystem

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.005

1004-5619（2015）06-0432-04

2015-07-31）

（本文编辑：李成涛）

公安部科技强警基础工作专项资助项目（2013GABJC 005）

刘亚楠（1981—），男，硕士，主检法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：dyndai@sina.cn

周怀谷，男，博士，主任法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com