气相色谱-质谱联用法检测香菇中香菇素的含量

周佳欣，白 冰，周昌艳*，邵 毅

（上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403）

气相色谱-质谱联用法检测香菇中香菇素的含量

周佳欣，白 冰，周昌艳*，邵 毅

（上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403）

建立测定香菇中香菇素的气相色谱-质谱联用检测方法。以乙腈提取样品，Florisil柱净化，使用气相色谱-质谱仪以选择离子监测模式进行分析测定。在设定色谱条件下，香菇素在1.0～20.0 μg/mL范围内线性良好；添加10.0、20.0、30.0 mg/kg香菇素溶液的平均回收率在86.61%～98.48%之间，相对标准偏差在2.92%～4.28%之间，检出限为0.10 mg/kg，定量限为0.25 mg/kg。本方法操作方便、重复性良好，为香菇中香菇素的定性和定量检测提供可靠的分析方法。

固相萃取；气相色谱-质谱法；香菇素

香菇不仅具有较高的营养和保健价值，还具有独特的风味，深受消费者青睐[1-2]。已经证实香菇鲜美之味主要来源于其核酸分解酶催化底物核酸生成的核苷酸物质[3-5]，而香菇的风味取决于其中含有的挥发性芳香物质[6]。含硫化合物通常能影响菇体整体的芳香，是香菇中最重要的香味来源[7-11]。香菇素化学名称为l,2,3,5,6-五硫杂环庚烷，是一种具有强烈的香菇特征风味的含硫杂环化合物，是由前体物质香菇酸在谷氨酸转肽酶的作用下产生二硫杂环丙烷中间体聚合而成的[10,12]，1966年被发现并命名为香菇素、香菇精[13-14]。化学结构式见图1。

图1 香菇素化学结构式Fig.1 Chemical structure of 1′2′3′5′6-pentathiepane

作为香菇中挥发性风味物质的重要成分之一，香菇素的检测技术研究受到广泛关注。国内外已有学者运用水蒸气蒸馏法[15]、溶剂萃取法、同时蒸馏萃取法[16]、固相微萃取法[17]、超临界萃取法[18]对香气成分进行萃取，并应用色谱、质谱及嗅闻技术对香菇的特征风味作了研究，鉴定了组成香菇特征风味的化合物[19-24]。但对于香菇素的定性、定量检测，国内外并没有检测标准。本实验对香菇中香菇素的含量检测方法进行研究，以香菇鲜样和香菇干样为研究对象，运用固相萃取、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术对香菇的特征风味物质进行定性和定量分析测定，旨在确定一种香菇中香菇素的检测分析方法，为香菇质量评价、风味改良、蘑菇风味料开发提供技术参数和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验用鲜香菇和干香菇由上海市周边地区某食用菌生产基地提供。鲜样：分取约500 g，切碎，用组织捣碎机匀浆后，置于密闭容器中。干样：分取约200 g，机械粉碎，过380 μm筛，混匀置于密闭容器中。

乙腈、正己烷、丙酮（均为色谱纯） 上海安谱科学仪器有限公司；弗罗里硅土柱（Florisil：3 mL，500 mg） 美国Agilent公司；香菇素标准品 中国Langchem公司。香菇素标准品用丙酮配制成质量浓度1 000 μg/mL标准储备溶液，梯度稀释为1、2、5、10、20 μg/mL的标准工作液。

1.2 仪器与设备

6890-5975C气相色谱-质谱联用仪（带有分流/不分流进样口及电子电离源） 美国Agilent公司； HR2096组织捣碎机 荷兰Philips公司；HY-5回旋式振荡器常州翔天实验仪器厂；Visiprer DL固相萃取装置 美国Supelco公司；QGC-361氮吹仪 上海泉岛公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

称取香菇鲜样5.00 g，香菇干样0.50 g需加入4.5 mL水混匀，准确加入10 mL乙腈，在回旋振荡器上以150 r/min转速振摇45 min后过滤，将滤液收集至加入4 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡1 min，静置15 min以上待分层。吸取2 mL上层有机相于烧杯中，50 ℃氮吹至近干，加入2 mL正己烷溶液溶解，待净化。

1.3.2 净化

参考NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》的净化方法并优化[25]，将Florisil柱用3 mL正己烷-丙酮（9∶1，V/V）溶液、2 mL正己烷溶液依次淋洗，当溶剂液面到达吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用试管接收洗脱液，用3 mL正己烷-丙酮溶液重复冲洗2 次，将装有洗脱液的试管置于氮吹仪上，50 ℃氮吹至近干，用2 mL正己烷溶液定容，在旋涡混合器上混匀，移入进样瓶中，待测。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：HP-5MS毛细柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；升温程序：初始温度50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升温至280 ℃保持5 min，后运行1 min；载气（He）流速1.0mL/min；进样量1.0 μL；不分流进样。

1.3.4 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度220 ℃；质量扫描范围m/z 50～550；选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）方式。

2 结果与分析

2.1 质谱分析条件的优化

图2 GC-MS 全扫描（A）、SIM（B）模式检测香菇素总离子流图Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of 1′2′3′5′6-pentathiepane standard

图3 鲜香菇（A）、干香菇（B）的GC-MS选择离子检测图Fig.3 GC-MS total ion chromatograms of 1′2′3′5′6-pentathiepane in fresh and dry Lentinula edodes

用弱极性HP-5MS毛细管柱，采用全扫描方式在m/z 50～550范围内分析香菇素标准溶液，然后根据保留时间和质谱图，确定其在SIM测定方式中的结束采集时间和监测离子。采用全扫描方式得到香菇素含量为1.0 mg/kg的总离子流图，如图2A所示，出峰时间为15.305 min。根据全扫描模式条件下的离子碎片丰度，选择m/z 142作为香菇素的定量离子，选择m/z 78、124、188作为香菇素的定性离子。以SIM模式得到香菇素含量为1.0 mg/kg的总离子流图，如图2B所示。以SIM模式检测干香菇和鲜香菇的样品，分别得到样品的选择离子扫描图，如图3所示。可以看到，在本实验条件下，香菇素得到了很好地分离，没有受到干扰，符合检测的方法要求。

2.2 标准曲线、检出限和定量限

根据香菇素在日常检测中的含量范围，建立标准曲线。配制标准溶液质量浓度分别为1、2、5、10、20 μg/mL，其线性方程如图4所示。结果表明，香菇素在1～20 μg/mL范围内，具有良好的线性关系，相关系数为0.992 8。

图4 香菇素质量浓度1～20 120μg/mL范围标准曲线Fig.4 Standard curve of 1′2′3′5′6-pentathiepane

从测定标准溶液（RSN＜20）的质量浓度得到的色谱图中，以3 倍信噪比（RSN=3）为检出限，以10 倍以上信噪比（RSN≥10）为定量限，计算得到香菇素的检出限为0.10 mg/kg，定量限为0.25 mg/kg。将实际样品稀释至该质量浓度进行相应的计算，结果显示，香菇素质量浓度为0.10 μg/mL时，可以完全响应，香菇素质量浓度为0.25 μg/mL时，可准确计算其含量。

2.3 方法的准确度

选取香菇鲜样、香菇干样作为空白基质做添加回收实验，在10.0、20.0 mg/kg和30.0 mg/kg 3 个水平进行添加回收实验（n=3）。结果如表1所示，香菇素的平均回收率在86.61%～98.48%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在2.92%～4.28%之间，证实该方法的准确度较高，满足测定要求。

表1 香菇鲜样、香菇干样的加标回收率和RRSSDDTable1 Spiked recovery and RSD of 1′2′3′5′6-pentathiepane in fresh and ddrryy Lentinula edooddeess

2.4 方法的精密度

选取香菇鲜样、香菇干样作为样品，按照上述方法分别平行测定5 次，求平均值和RSD，RSD分别为4.13%和3.60%，结果表明该方法精密度较高（表2）。

表2 香菇鲜样、香菇干样的香菇素精密度实验结果Table2 Precision (expressed as RSD of the method for replicate determinations of fresh andd ddrryy Lentinula edodes

3 结 论

本实验针对香菇中香菇素建立一种固相萃取、GC-MS-SIM检测方法。利用乙腈良好的提取能力，Florisil层析柱的净化效果，达到了操作简单、处理快速、节省溶剂的目的。在GC-MS-SIM模式下，方法检出限为0.10 mg/kg，定量限为0.25 mg/kg，添加10.0、20.0、30.0 mg/kg 3 个水平条件下的平均回收率在86.61%～98.48%之间，RSD在2.92%～4.28%之间。采用固相萃取进行样品的前处理方 法耗时短、选择性好、基质干扰小，而GC-MS-SIM方法准确度和精密度高，满足了检测的要求。

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Determination of 1′2′3′5′6-Pentathiepane in Lentinula edodes by Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ZHOU Jiaxin BAI Bing ZHOU Changyan*′SHAO Yi
(Institute for Agri-Food Standards and Testing Technology Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403′China)

A simple and rapid method was developed for determining 1,2,3,5,6-pentathiepane in Lentinula edodes by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Samples were extracted by acetonitrile, purifi ed by solid-phase fl orisil column and detected by GC-MS under selective ion monitoring mode. Good linear correlation was obtained within the concentration range of 1,2,3,5,6-pentathiepane between 1.0 and 20.0 μg/mL, under the chromatographic conditions used in this study. The average recovery rates of 1,2,3,5,6-pentathiepane at spiked concentrations of 10.0, 20.0 and 30.0 mg/kg were between 86.61% and 98.48%, with relative standard deviation of 2.92%?4.28%. The detection limit and quantifi cation limit were 0.10 and 0.25 mg/kg, respectively. This method has the advantages of convenient operation and good reproducibility, which is suitable for determining 1,2,3,5,6-pentathiepane in Lentinula edodes.

solid-phase extraction; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); 1,2,3,5,6-pentathiepane

O657

A

1002-6630（2015）06-0151-04

10.7506/spkx1002-6630-201506028

2014-07-08

2014年国家食用菌质量安全风险评估项目（GJFP2014005）；上海市市级农口系统青年人才成长计划课题（沪农青字（2014）第1-7号）

周佳欣（1982—），女，助理研究员，博士，研究方向为农产品中农药残留分析、食用菌风味物质。E-mail：zhou_jx@126.com

*通信作者：周昌艳（1969—），女，研究员，博士，研究方向为食用菌中农药残留检测技术。E-mail：changyanz@sina.com