化脓性汗腺炎一家系γ－分泌酶基因突变检测

刘 勇徐浩翔惠 云张晓峰肖学敏李诚让∗王宝玺∗

·论著·

化脓性汗腺炎一家系γ－分泌酶基因突变检测

刘 勇1＃徐浩翔2，3＃惠 云4张晓峰2，3肖学敏2，3李诚让2，3∗王宝玺2，3∗

目的: 检测一化脓性汗腺炎(HS)家系γ－分泌酶基因亚基(PS－1，PENEN－2，APH－1，NCSTN)的突变。方法: 提取一化脓性汗腺炎家系及50名无亲缘关系的健康对照血DNA，采用PCR技术扩增PS－1、PENEN－2、APH－1和NCSTN基因的全部外显子，经测序、比对确定致病基因突变位点。结果: 该家系HS患者均存在NCSTN c.1300 C＞T(p.R434X)突变，而该家系正常成员及50名健康对照者未发现该突变，检索NCBI网站单核苷酸多态性(SNP)数据库亦未发现该突变。其余3个亚基未检测到突变位点。结论: NCSTN基因c.1300C＞T突变可能是该家系的致病基因位点。

反常性痤疮； 基因突变； γ－分泌酶基因

化脓性汗腺炎(hidradenitis suppurativa，HS)，又名反常性痤疮，是一种好发于顶泌汗腺分布部位的炎症性皮肤病，国外报道其发病率为0.2%～4%，属于显性遗传性皮肤病，伴不完全外显率，约三分之一的HS患者有家族史。Wang等首先发现本病与γ－分泌酶的突变相关。1γ－分泌酶(γ－secretase)是一种跨膜蛋白，由4个亚基1∶1∶1∶1组成，它们分别为早老素－1 (presenilin－1，PS－1)、早老素增强子－2(presenilin enhancer－2，PENEN－2)、前咽缺陷因子(anterior－pharynx－defective－1，APH－1)和NCSTN(nicastrin)。我们新近收集到一个HS家系，对该家系成员进行了γ－分泌酶不同亚基的突变检测，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 先证者，男，29岁。13岁时面部出现绿豆大红色硬结，轻度疼痛，偶化脓，愈合后留下凹陷性瘢痕，并在腋下、臀部、腹股沟等处出现类似皮损，以“痤疮、毛囊炎”等给予“消炎药”等治疗，效果欠佳。10多年来，病情迁延，皮损愈合后多留下瘢痕。皮肤科情况:面部可见较多凹陷性细小瘢痕，散在绿豆大丘疹、结节，躯干、腋下散在黄豆至蚕豆大、淡红色结节，压痛(＋)，无脓性分泌物(图1A)；臀部可见数枚大小不等的瘢痕伴色素沉着(图1B)。

患者皮损符合HS的诊断标准:2(1)典型皮损:初期皮损为深在性、痛性结节(未破溃的疖肿)，后期为脓肿、窦道、瘢痕形成及黑头粉刺；(2)典型部位:腋窝、臀部、腹股沟、肛周、乳房下等皱褶部位；(3)慢性和复发性。故诊断为化脓性汗腺炎。家族中可见多位患者(图2)。

图1 先证者腋窝(A)和臀部(B)皮损

图2 反常性痤疮家系图

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA制备 本研究获得中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会批准，在获得知情同意书的基础上，分别抽取先证者(III 1)、家系成员(II 1、II 3、II 5、III 2)及50名家系以外的正常人外周静脉血5 mL，2%乙二胺四乙酸抗凝，用全血基因组DNA提取试剂盒(美国Promega公司)提取外周血DNA，实验步骤按说明书进行。

1.2.2 PCR扩增目的基因以及DNA测序 引物设计与合成:根据NCSTN、PSEN－1、PSENEN－2、APH－1基因的所有外显子设计引物，扩增患者及50名正常对照的上述基因的外显子及侧翼序列(引物序列见参考文献1)。

PCR条件:反应体系50μL:Mix(为dNTP、Taq酶和缓冲液的混合物)25μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，加入ddH2O补足50μL。所有外显子均选用单循环PCR方法扩增。反应条件:95℃预变性3 min，进行以下14个循环:95℃变性30 s，63℃退火45 s(以后每个循环退火温度减少0.5℃)，72℃延伸75 s，接着进行27个循环:95℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸75 s；共41个循环，最后72℃延伸5 min。

15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物。所有PCR扩增产物纯化后送至英潍捷基(上海)公司测序，采用ABI 3730全自动DNA测序仪进行序列测定，测序结果用BLAST软件比对分析。

2 结果

先证者 PSEN1、NCSTN、PSENEN和APH1所有外显子采用PCR扩增，其产物经测序比对后发现，NCSTN基因第11号外显子存在c.1300 C＞T(p. R434X)无义突变(图3)，随后在该家系其他成员中测序该外显子，发现所有患者均存在该突变，而该家系正常成员未发现。再检测50名健康对照者未发现该突变，查询美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站单核苷酸多态性(SNP)数据库，未发现该突变。

图3 NCSTN基因测序图

3 讨论

HS是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，以腋下、腹股沟、会阴、臀部等部位出现炎性丘疹、囊肿、结节、脓肿、窦道和瘢痕形成为特征，部分皮损疼痛明显且伴恶臭气味，给患者带来极大的痛苦。由于HS早期主要表现为毛囊上皮增生导致的毛囊口闭塞，发病机制与痤疮类似，汗腺的损害是受累于毛囊而非原发的，所以，现在本病常称之为反常性痤疮。3，4

本病病因复杂，遗传因素、细菌感染、免疫功能改变、性激素等多种因素参与了HS的发病。在HS的遗传研究方面，我国学者位于世界前列。2006年，Gao等报道了对一个汉族HS家系进行全基因组扫描，将致病基因位于1p21.1－1q25.3。5随后，宿斌等对2个 HS汉族家系进行研究，在染色体 19q13.1－19q13.3定位了一个新的致病基因位点。由于上述区域中基因数目庞大，研究者未能最终确定致病基因。但是，Al－Ali对2个HS大家系进行连锁分析，发现HS致病基因不与1号染色体连锁。6直到Wang等首次提出家族性AI的发病是由γ－分泌酶不同亚单位的基因突变引起的。1这一研究结果被国内外学者认

同并进一步证实。7－11目前，国内外学者报道的与 HS相关的γ－分泌酶突变主要出现在NCSTN亚基。

我们对该三代含有4例患者的HS家系γ－分泌酶的PS－1、PENEN－2、NCSTN和APH－1亚基的外显子检测发现，NCSTN亚基第11号外显子出现了 c. 1300 C＞T(p.R434X)无义突变，正常健康对照及SNP数据库未发现该突变，说明该突变是HS新的致病性突变。这一突变导致第434位的精氨酸变为终止密码子，引起其后大片段氨基酸缺失，对该基因编码的蛋白NCSTN结构完整性产生影响，进而可能影响γ－分泌酶发挥正常功能，从而导致HS临床表型的出现。该突变位点与Miskinyte等报道的法国患者中出现的NCSTN突变一致，12这也是目前报道的唯一的、不同人种中出现的NCSTN基因相同位点出现的相同突变，该突变是否为热点突变，仍有待于进一步验证与研究。

总之，在本研究调查的家系中，NCSTN亚基出现的无义突变为新突变，这为更好的认识并探索γ－分泌酶基因型与HS患者临床表现之间的联系奠定了基础。

志谢:感谢广州市皮肤病防治所叶兴东主任医师对本文家系资料收集给予的帮助。

1Wang B，YangW，WenW，etal.Gamma－secretase genemutations in familial acne inversa.Science，2010，330(6007):1065.

2 Danby FW，Margesson LJ.Hidradenitis suppurativa.Dermatol Clin，2010，28(4):779－793.

3 Sellheyer K，Krahl D.“Hidradenitis suppurativa”is acne inversa!An appeal to(finally)abandon amisnomer.Int JDermatol， 2005，44(7):535－540.

4曹元华.毛囊闭锁三联征的诊断与治疗研究现状.中华皮肤科杂志，2008，43(6):436－437.

5 Gao M，Wang PG，Cui Y，et al.Inversa acne(hidradenitis suppurativa):a case report and identification of the locus at chromosome 1p21.1－1q25.3.J Invest Dermatol，2006，126(6): 1302－1303.

6Al－Ali FM，Ratnamala U，Mehta TY，et al.Hidradenitis suppurativa(or Acne inversa)with autosomal dominant inheritance is not linked to chromosome 1p21.1－1q25.3 region.Exp Dermatol，2010，19(9):851－853.

7 Liu Y，Gao M，Lv YM，et al.Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa (hidradenitis suppurativa).J Invest Dermatol，2011，131(7): 1570－1572.

8 Li CR，Jiang MJ，Shen DB，et al.Two novelmutations of the nicastrin gene in Chinese patientswith acne inversa.Br JDermatol，2011，165(2):415－418.

9Nomura Y，Nomura T，Sakai K，etal.A novel splice sitemutation in NCSTN underlies a Japanese familywith hidradenitis suppurativa.Br JDermatol，2013，168(1):206－209.

10任伟萍，王李云，梅爱华，等.毛囊闭锁三联征一家系调查及致病基因突变检测.中华皮肤科杂志，2012，45(12):847－850.

11 Pink AE，Simpson MA，Brice GW，et al.PSENEN and NCSTNmutations in familial hidradenitis suppurativa(Acne Inversa).J Invest Dermatol，2011，131(7):1568－1570.

12Miskinyte S，Nassif A，Merabtene F，etal.Nicastrinmutations in French families with hidradenitis suppurativa.J Invest Dermatol，2012，132(6):1728－1730.

(收稿:2014－09－17 修回:2014－10－30)

Mutations in subunits ofγ－secretase gene in one fam ily with hid radenitis suppurativa

LIU Yong，XU Hao-xiang，HUIYun，et al.Department of Dermatology，Xinjiang Uygur Autonomous Region Peoples Hospital，Urumqi，830002

Objective:To identify mutations in subunits(PS－1，PENEN－2，APH－1 and NCSTN)ofγsecretase gene in one family with hidradenitis suppurativa(HS).M ethods:Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the family and 50 healthy controls.All the exons of PS－1，PENEN－2，APH－1 and NCSTN were amplified by PCR.Direct sequencing was performed to screen themutations in those genes.Results:Onemissensemutation(c.1300 C＞T，p.R434X)in NCSTN was identified in all patients，which was not found in healthy members of the family，controls and nucleotide polymophism(SNP)database of NCBI. There were nomutations in PS－1，PENEN－2，APH－1.Conclusion:Themutation in NCSTN ofγ－secretase genemay be associated with HS in this family.

hidradenitis suppurativa；genemutation；γ－secretase gene

国家自然科学基金(编号:81101207，81472905)教育部高校博士点基金(编号:20111106120052)中央高校基本科研业务费专项资金＆北京协和医学院青年基金(编号:3332013056)杨森科研基金(编号:JRCC2011－皮－01)

1新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科，乌鲁木齐，830002 2中国医学科学院皮肤病医院(研究所)，江苏南京，210042 3江苏省皮肤性病分子生物学重点实验室，江苏南京，210042 4南京军区总医院皮肤科，江苏南京，210002＃共同第一作者∗通信作者