糖皮质激素受体基因多态性与大疱性类天疱疮糖皮质激素抵抗的相关性研究

王德全王玉国陈宗燕刘保国苗国英张合恩吴 平姜 斌

糖皮质激素受体基因多态性与大疱性类天疱疮糖皮质激素抵抗的相关性研究

王德全1王玉国2陈宗燕2刘保国3∗苗国英3张合恩3吴 平3姜 斌3

目的: 检测糖皮质激素受体基因多态位点(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)，明确其与大疱性类天疱疮糖皮质激素(以下简称激素)抵抗的相关性。方法: 提取激素敏感组(40例)、激素抵抗组(48例)及健康对照组(42名)外周血DNA，应用SNaPshotSNP分型技术进行GR基因多态性位点(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)检测。结果: 激素敏感组、激素抵抗组和健康对照组均检出BclI有3种基因型CC、CG、GG，差异无统计学意义(P＞0.05)；N363S、ER22/23EK、9β基因位点不存在多态性。结论: GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β多态性与BP激素抵抗可能无相关性。

糖皮质激素受体； 基因多态性； 大疱性类天疱疮

大疱性类天疱疮(BP)是一个好发于老年人的大疱性皮肤病。患者病情较重，临床上以躯干、四肢出现张力性大疱为主要特点，黏膜损伤较为少见。1糖皮质激素是治疗大疱性类天疱疮(BP)的首选药物。糖皮质激素(glucocorticoid，GC，简称为激素)的效应由糖皮质激素受体(GR)介导实现，然而GC治疗存在个体差异，甚至出现治疗抵抗。有研究报道，2，3糖皮质激素受体基因多态性对GR功能产生影响，被认为是GC抵抗的重要分子机制之一。本研究通过分析糖皮质激素受体(GR)基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β单核苷酸多态性(SNP)，探讨其与大疱性类天疱疮激素抵抗的相关性，为阐明激素抵抗形成机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 临床诊断参照《中国临床皮肤病学》和《皮肤性病学》制定的BP诊断标准，主要根据病史、临床表现、组织病理及免疫荧光病理确诊。4回顾既往病案，据患者病情轻重，GC治疗量相当于泼尼松0.5～1.0 mg/(kg·d)，1周内病情得到控制，列入激素敏感组，如1周内病情未控制，则在原有剂量的基础上增加50%，如果1.5 mg/(kg·d)仍未能控制病情，则该患者列入激素抵抗组，如果患者控制病情的GC用量≤1.5 mg/(kg·d)，则列入激素治疗敏感组。激素敏感型类天疱疮患者40例、激素抵抗型类天疱疮患者48例。外周血标本取自河北工程大学附属医院2006年1月至2013年12月皮肤科门诊及住院患者，健康对照组42例外周血标本采自河北工程大学附属

医院健康体检者，无自身免疫性疾病病史。各组研究对象均为河北籍汉族。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 从患者外周血提取基因组DNA，抽提方法参照试剂盒(DP318离心柱型，北京TIANGEN公司)说明书进行操作，DNA样品置于－20℃保存。

1.2.2 引物设计 在Pubmed SNP入口检索GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β的SNP位点相关信息，并参考文献资料，5使用Primer 5.0引物设计软件设计引物，引物序列见表1。

1.2.3 PCR扩增目的基因 使用1管便携式PCR扩增试剂/2×Taq PCR MasterMiX/KT201－01(北京TIANGEN公司)。PCR反应条件:95℃变性5 min，95℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s，共进行42个循环，72℃延伸5 min。PCR操作步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物 取混匀的PCR产物6μL点样，阴性对照上样量为10μL，每点样一次均换枪头，避免污染产物。在本次的电泳图中，所使用的marker均为DL2000 marker(条带由下至上分别为100 250 500 750 1000 2000，图1)。

1.2.5 PCR产物序列分析 纯化后的PCR产物经酶消化后，送北京金维智公司进行测序。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计算各组各位点基因型分布频率及等位基因频率，确认其符合Hardy－Weinberg平衡。各组间等位基因和基因型比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组基因位点遗传平衡检验 对敏感组、抵抗组和对照组4个SNP位点(N363S、ER22/23EK、BclI、9β)分别进行Hardy－Weinberg平衡吻合度检验，结果均P＞0.05，说明敏感组、抵抗组和对照组均符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律，数据来自同一孟德尔群体，具有群体代表性。

2.2 GR基因N363S、ER22/23EK、BclI、9β多态性位点DNA片段测序图 敏感组、抵抗组和对照组均检出BclI(rs41423247)IVS1184＋646位点存在C→G的碱基变异(实验组测序图见图2)。N363S、ER22/ 23EK、9β3个基因位点未检出碱基变异。

表1 4个基因位点PCR引物序列

图1 琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增产物

图2 实验组BclI位点基因突变测序图(红框所示为基因突变位点)

2.3 GR基因型的分布及等位基因频率 BclI的3种基因型(CC、CG、GG)在敏感组、抵抗组和对照组中的分布如表2，经χ2检验，差异无统计学意义(P＝0.886)。3组BclI等位基因G、C在敏感组频率分别为19%和81%，在抵抗组分别为26%和74%，在对照组分别为22%和78%，3组之间差异无统计学意义(P＝0.962)。N363S、ER22/23EK、9β基因位点仅检出一种基因型，分别为AA、GG、AA，基因分布频率在敏感组、抵抗组和对照组均为100%，差异无统计学意义(χ2＝0，P＞0.05)，见表3。

表2 3组BclI位点基因型和等位基因频率比较

表3 2组N363S、ER22、9β位点基因型和等位基因频率比较

3 讨论

随着人类基因组图谱绘制的日益完善，其中蕴含着众多单核苷酸多态性(SNPs)已受到分子生物学研究者的普遍关注和研究。因为SNPs是用以确定候选基因的新一代遗传标记，有助于发现人类的一些复杂疾病相关基因。另外，也越来越多地用来探讨同一基因、不同基因的SNPs连锁关系，及其与疾病易感性、致病性等关系。

研究表明，糖皮质激素受体基因存在多个多态性基因位点，其中包括N363S、ER22/23EK、BclI、9β、 D641V等，突变可导致基因转录活性丧失或下降、一些多态性基因蛋白表达产物活性降低甚至不具有生物活性等，最终导致受体表达数量降低或受体亲和力下降。6，7因此，GR基因多态性与激素抵抗现象很可能有关。

N363S多态性是位于GR基因2号外显子上，N363S多态性是指野生型的1220位上的碱基A被G替代，其编码363号氨基酸由天冬酰胺变成丝氨酸，丝氨酸残基可以提供磷酸化位点，高度磷酸化的GR基因表达增强，因而提高了GR对糖皮质激素的敏感

性。8有报道称相比正常的GR，N363S能够调节一些新的基因，其产生的影响可能提高GC的敏感性，但具体机制至今尚未十分清楚。9对于该多态性与疾病的关系，国内外学者已进行了很多研究，主要集中在与代谢性疾病和心血管疾病的关系上。而对于N363S多态性与 BP的研究甚少。本研究对3组N363S基因多态性进行筛查发现，敏感组、抵抗组和对照组均未发现N363S存在多态性，基因型均为AA，表明GR基因N363S多态性与BP激素抵抗可能无明显相关性。

ER22/23EK多态性位于GR基因2号外显子上，是22号和23号密码子上两个连锁的单核苷酸突变，其中22号密码子上突变(GAG突变为GAA)不会引起氨基酸改变均编码谷氨酸，但是后一个突变(AGG突变为AAG)使精氨酸变成赖氨酸。10这两种多态性变化改变了受体表达和功能，从而影响了疾病易感性及临床表现多样性，对GC疗效也有一定程度的影响。本研究对3组ER22/23EK多态性的检测结果显示:基因型均为GG，无突变型存在，从而表明与BP抵抗无相关性。

BclI多态性是指位于在GR基因2号外显子下游646位点处有一突变:C→G，可能产生2.2 kb和3.9 kb长度的两个片段。11文献报道中，与临床关联最多的人类糖皮质激素基因(nuclear receptor superfamily3，groupC，member1，NR3Cl)的多态性位点就是BclI，该位点存在CC、CG、GG 3种基因型。通过影响GR来提高糖皮质激素(GC)的敏感性，由于BclI多态性在内含子，既不与编码氨基酸的密码子有关，也不与基因的调节和断裂点有关，故糖皮质激素治疗BP产生激素抵抗及耐药机制尚不清楚，可能是因位于基因编码的起始区，或者与某个具有功能的重要多态性相连等。12研究发现，敏感组、抵抗组和对照组BclI位点基因型分布差异无统计学意义，3组人群等位基因C所占比例均为80%左右，提示可能存在种族特异性。国内对BclI基因多态性与BP激素抵抗的研究较少，本研究虽得出阴性结果，但仍需在更大样本人群中进行重复研究及对BclI基因多态性与BP治疗反应性进行相关性研究。

9β是GR外显子9β上ATTTA→GTTTA，A→G的核苷酸突变导致GRβmRNA转录增多，抑制GRa与激素的结合，从而降低细胞对激素的敏感性，导致激素耐受。南亚人群中该等位基因G的频率为0.166，与欧洲人群筛查结果相同。13目前在中国人群中对该位点的临床意义尚无相关研究。本研究显示，该位点仅发现基因型AA，未发现其他等位基因，与BP激素抵抗无明显相关性。

此次研究未能发现BP与GR基因N363S、ER22/ 23EK、BclI、9β位点SNP相关性，分析原因可能是: (1)GR基因可能与BP激素抵抗相关性较低。(2)本研究尚有自身局限性，只选取了GR基因的4个位点，研究范围较窄，GR基因其他位点多态性与BP激素抵抗关系还有待进一步探讨。(3)未发现N363S、ER22/23EK、9β多态性存在，说明这3个位点在汉族人群中突变率较低，甚至可能不存在突变。本文只是对GR基因多态性与BP激素抵抗的初步研究，对于GR基因多态性与GC治疗疗效的关系还有待进一步探讨。该研究可能由于样本量小，其确切结论尚需扩大样本量进一步研究。

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(收稿:2014－09－19 修回:2014－11－06)

Correlation between glucocorticoid recep tor gene polymorphism and glucocorticoid resistance in the patients w ith bullous pem phigus

WANG De-quan，WANG Yu-guo，CHEN Zong-yan，et al.Chengde Medical College，Chengde，067000

Objective:To detect the genotype frequency of polymorphic loci(N363S，ER22/23EK，BclI，9β)of glucocorticoid receptor(GR)gene to determine the correlation between glucocorticoid receptor gene polymorphism and glucocorticoid resistance in the patientswith bullous pemphigus(BP).M ethods:Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in the glucocorticoid sensitivity group(40 patients)，glucocorticoid resistance group(48 patients)and 42 healthy controls.Themutations in polymorphic lociwere detected by SNaPshotSNP.Resu lts:Three kindsofgenotypes(CC，CG and GG)of BclIwere identified in the three groups，with no significantdifference among them(P＞0.05).Therewas no polymorphism of N363S，ER22/23EK and 9βin the three groups.Conclusion:The polymorphism of GR genemay not be correlated with the glucocorticoid resistance in the patientswith BP.

glucocorticoid receptor；gene polymorphism；bullous pemphigoid

1承德医学院，河北承德，067000 2东平县皮肤病防治所，山东东平，271500 3河北工程大学附属医院皮肤科，河北邯郸，056002∗通信作者