白藜芦醇对HaCaT细胞ABCA12蛋白表达的影响

李 军 陈谨萍 吴 伽

·论著·

白藜芦醇对HaCaT细胞ABCA12蛋白表达的影响

李 军 陈谨萍 吴 伽

目的: 确定白藜芦醇对角质形成细胞ABCA12表达的影响。方法: DMEM培养基培养HaCaT细胞，分别设空白组、白藜芦醇处理组和过氧化氢处理组、联合处理组。流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平，Real－time PCR检测ABCA12 mRNA的表达，Western blot检测ABCA12蛋白的表达。结果: 空白组、白藜芦醇处理组、过氧化氢处理组、联合处理组ROS水平分别为14.46±1.24、14.31±0.93、201.82±12.52、76.29±5.76，空白组、白藜芦醇处理组组间比较无显著差异(P＞0.05)，其它各组间比较差异极为显著(P＜0.01)。ABCA12 mRNA水平分别为1.00±0.23、2.39±0.58、0.19±0.06、0.73± 0.13，各组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。蛋白表达水平分别为1.00±0.14、1.85±0.30、0.17± 0.04、0.55±0.07，各组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论: 氧化应激下调角质形成细胞的ABCA12表达；白藜芦醇除了抗氧化作用外，还可以上调ABCA12的表达。

白藜芦醇； ABCA12； 抗氧化

目前在许多皮肤疾病发病机制研究中，皮肤屏障功能日益受到关注。ABCA12(Adenosine triphosphate–binding cassette A12)作为一种ABC家族脂质转运体，位于板层小体包膜，参与板层小体的形成，对维持正常的皮肤屏障功能起重要作用。1白藜芦醇具有抗老化、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、免疫调节等一系列生物活性，2，3但在角质形成细胞脂质代谢和转运过程中是否发挥作用尚无定论。本实验建立表皮细胞氧化应激模型，通过白藜芦醇的干预来研究其对表皮的抗氧化保护作用，探讨白藜芦醇对表皮细胞ABCA12表达及皮肤屏障功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及来源 人表皮细胞系HaCaT，购自中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要试剂和仪器 DMEM培养液(德国Biochrom公司)、10%胎牛血清(德国Biochrom公司)、白藜芦醇(美国 Sigma公司)、1mmol/L H2O2(美国Sigma公司)、Trizol(美国 Invitrogen公司)、DNaseI (Rnase Free)(TaKaRa，大连宝生物公司)、SYBR ExscriptTMRT－PCR Kit(TaKaRa，大连宝生物公司)、引物由上海英骏公司合成，DAFC抗体(美国Sigma公

司)，小鼠抗人 ABCA12、GAPDH一抗(美国 Santa Cruz公司)、HRP标记的羊抗小鼠二抗(美国 Santa Cruz公司)、ECL蛋白印迹发光试剂盒(美国 Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养HaCaT细胞采用DMEM培养基，添加10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL和链霉素100 mg/L。培养条件为37℃含5%CO2饱和湿度孵箱孵育。

1.2.2 HaCaT细胞系处理及分组 根据是否采用白藜芦醇预先干预及过氧化氢处理，设为4组(每组5例):空白组采用100 μL培养液预先干预24 h，继以100 μL PBS缓冲液处理24 h；白藜芦醇处理组采用0.25 μmol/L白藜芦醇预先干预24 h，继以100 μL PBS处理24 h；过氧化氢处理组采用100 μL培养液预先干预24 h，继以200 μmol/L过氧化氢处理24 h；联合处理组采用0.25 μmol/L白藜芦醇预先干预24 h，继以200 μmol/L过氧化氢处理24 h。取处理后细胞继续以下检测。白藜芦醇浓度选择药液培养细胞活性无明显降低，且相对较高的浓度0.25 μmol/L；过氧化氢浓度选择半致死浓度200 μmol/L。

1.2.3 细胞内活性氧(ROS)检测 调整细胞为1×l05个/孔，接种于培养板，每孔1 mL。同上处理后弃原液，胰酶消化，培养液中和，移入EP管离心3 min (4000 r/min)，弃上清液，每管加入 PBS 800 μL、DAFC抗体0.2 μL，37℃ 30 min温育，流式细胞仪检测。

1.2.4 总RNA的提取及Real－Time RT－PCR检测按照试剂盒说明书进行操作。ABCA12特异引物: a1，5'－CCACAAGGAGCATAAGAA－3'；a2，5'－ATACAACCCAGGCGACCA－3'，产物片段258 bp。内参照GAPDH特异引物:b1，5'－TCCTCCACCTTTGACGCT－3'；b2，5'－CCACCACCCTGTTGCTGT－3'，产物长度为103bp。采用20 μL反应体系，PCR反应条件:95℃预变性10 s；95℃变性5 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40个循环。

1.2.5 ABCA12表达的Western blot检测 各组细胞提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，约20 μg总蛋白于6%SDS－PAGE凝胶中4 mA恒流电泳，恒压100 V将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，含5%脱脂奶粉的PBS封闭液4℃封闭过夜，加入小鼠抗人ABCA12、GAPDH一抗(稀释浓度为1∶1000)室温孵育2 h，PBS洗膜后，加入1∶3000 HRP标记的羊抗小鼠二抗，室温孵育1 h，PBS洗膜后，加入化学发光剂，生物图像分析仪(Pharmacia，瑞典)成像，以GAPDH为内参照进行半定量分析。

1.2.6 统计学方法 计量资料采用¯x±s表示，组间差异采用单因素方差检验，组间两两比较采用SNK检验，实验数据经SPSS 16.0统计软件包处理，显著性水准α设为0.05。

2 结果

2.1 ROS检测水平 空白组、白藜芦醇处理组、过氧化氢处理组、联合处理组各组ROS水平分别为14.46 ±1.24、14.31±0.93、201.82±12.52、76.29±5.76(图1)。空白组、白藜芦醇处理组组间两两比较差异无统计学意义(P＞0.05)，其它各组间两两比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 各组表皮细胞ROS值

2.2 ABCA12的核酸转录水平 过氧化氢处理组＜联合处理组＜空白组＜白藜芦醇处理组。空白组、联合处理组组间两两比较差异无统计学意义，其它各组间两两比较差异有统计学意义(表1)。

2.3 ABCA12的蛋白表达水平 过氧化氢处理组＜联合处理组＜空白组＜白藜芦醇处理组。各组间两两比较差异有统计学意义(表1)。Western blot检测见图2。

表1 各组ABCA12的核酸转录及蛋白表达相对水平

转录水平空白组、联合处理组组间比较P＞0.05；蛋白表达空白组、联合处理组组间比较P＜0.05，其它各组间两两比较P＜0.01

图2 各组表皮细胞ABCA12表达的变化

3 讨论

ABCA12位于板层小体包膜，可将葡萄糖基神经酰胺转运至板层小体，并将其转变为神经酰胺，神经酰胺随后被转运至角质形成细胞表面，参与皮肤脂质的形成，故ABCA12在皮肤屏障功能的维持和恢复过程中具有重要作用。4，5白藜芦醇被认为能激活SIRTl，具有抗细胞老化功能，也可激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子－1α(PGC－lα)，具有重要的抗氧化功能。6，7

在本实验中发现，氧化应激的过氧化氢处理组ROS表达较空白组明显增高，ABCA12表达则下降，说明表皮细胞在氧化应激状态下出现ABCA12表达下降，可能使皮肤屏障功能降低。联合处理组ROS表达较空白组稍增高，但较过氧化氢处理组降低，而ABCA12表达与空白组相差无几，说明白藜芦醇可通过抗氧化保护作用来减少ABCA12表达下降的程度，从而减少氧化应激对皮肤屏障功能的影响。白藜芦醇处理组ROS表达较空白组无明显变化，ABCA12表达稍有上升，说明在表皮细胞正常培养状态下，白藜芦醇本身亦可导致ABCA12表达增高，有助于皮肤屏障功能恢复。

故此认为氧化应激导致表皮细胞ABCA12表达下降，白藜芦醇除了通过抗氧化保护作用来上调ABCA12表达外，理应还存在其他调控途径。有研究表明白藜芦醇能激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)，而AMPK是代谢过程的关键调节分子，可上调NAD＋水平并激活SIRTl和PGC－lα，8目前还难以明确白藜芦醇是否能直接激活SIRTl和PGC－lα。另外有学者认为白藜芦醇可激活 cAMP特异性的磷酸二酯酶(PDE)，参与炎性反应、脂肪生成、离子通道功能等多项生理活动。9，10所以还有诸多白藜芦醇参与的调控途径和方式有待进一步研究。

1 Akiyama M.The roles of ABCA12 in keratinocyte differentiation and lipid barrier formation in the epidermis.Dermatoendocrinol，2011，3(2):107－112.

2 Miki H，Uehara N，Kimura A，et al.Resveratrol induces apoptosis via ROS－triggered autophagy in human colon cancer cells. Int J Oncol，2012，40(4):1020－1028.

3 Yuan Y，Xue X，Guo RB，et al.Resveratrol enhances the antitumor effects of temozolomide in glioblastoma via ROS－dependent AMPK－TSC－mTOR signaling pathway.CNS Neurosci Ther，2012，18(7):536－546.

4 Zuo Y，Zhuang DZ，Han R，et al.ABCA12 maintains the epidermal lipid permeability barrier by facilitating formation of ceramide linoleic esters.J Biol Chem，2008，283(52):36624－36635.

5 Jiang YJ，Uchida Y，Lu B，et al.Ceramide stimulates ABCA12 expression via peroxisome proliferator－activated receptor{delta} in human keratinocytes.J Biol Chem，2009，284(28):18942－18952.

6 Yaseen A，Chen S，Hock S，et al.Resveratrol sensitizes acute myelogenous leukemia cells to histone deacetylase inhibitors through reactive oxygen species－mediated activation of the extrinsic apoptotic pathway.Mol Pharmacol，2012，82(6):1030－1041.

7 Hirzel E，Lindinger PW，Maseneni S，et al.Differential modulation of ROS signals and other mitochondrial parameters by the antioxidants MitoQ，resveratrol and curcumin in human adipocytes.J Recept Signal Transduct Res，2013，33(5):304－312.

8 Hong SH，Lee HJ，Sohn EJ，et al.Anti－nephrolithic potential of resveratrol via inhibition of ROS，MCP－1，hyaluronan and osteopontin in vitro and in vivo.Pharmacol Rep，2013，65(4): 970－979.

9 Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide－Induced apoptosis via the NF－Kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes.Biomol Ther(Seoul)，2013，21(5):364－370.

10 Farris P，Krutmann J，Li YH，et al.Resveratrol:a unique antioxidant offering a multi－mechanistic approach for treating aging skin.J Drugs Dermatol，2013，12(12):1389－1394.

(收稿:2014－06－11 修回:2014－08－31)

Effects of resveratrol on ABCA12 expression in HaCaT cells

LI Jun，CHEN Jin-ping，WU Jia.Department of Dermatology，Newborn Screening Center，Guangzhou Women and Children's Medical Center，Guangzhou，510623

Objective:To determine the influence of resveratrol on ABCA12 expression in HaCaT cells. Methods:HaCaT cells cultured in DMEM were divided into the blank group，resveratrol group，hydrogen peroxide group and resveratrol combined hydrogen peroxide group.The level of reactive oxygen species(ROS) was detected by flow cytometry.The level of ABCA12 mRNA was detected by RT－PCR and the expression level of ABCA12 protein was detected by Western blot.Results:The level of ROS in the blank control group，resveratrol group，hydrogen peroxide group and resveratrol combined hydrogen peroxide group was 14.46± 1.24，14.31±0.93，201.82±12.52 and 76.29±5.76 respectively.There was no significant difference between blank group and resveratrol group(P＞0.05).The differences between other groups were highly significant(P＜0.01).The level of ABCA12 mRNA was 1.00±0.23，2.39±0.58，0.19±0.06 and 0.73±0.13 respectively. There was a significant difference among four groups(P＜0.05).The expression level of ABCA12 protein was 1.00±0.14，1.85±0.30，0.17±0.04 and 0.55±0.07 respectively.There was a significant difference among four groups(P＜0.05).Conclusion:Oxidative stress inhibits the expression of ABCA12 in cells.Besides antioxidant protection，resveratrol up－regulate the expression of ABCA12.

resveratrol；adenosine triphosphate－binding cassette A12；antioxidant

广州市妇女儿童医疗中心，广东广州，510623