人参皂苷Rg1保护UVB所致皮肤成纤维细胞急性损伤

刘 勇徐浩翔惠 云张晓峰肖学敏王宝玺☆∗

·论著·

人参皂苷Rg1保护UVB所致皮肤成纤维细胞急性损伤

刘 勇1☆徐浩翔2，3∗惠 云4张晓峰2，3肖学敏2，3王宝玺2，3☆∗

目的: 确定人参皂苷Rg1对UVB损伤成纤维细胞的保护作用。方法: 体外培养人皮肤成纤维细胞，分为正常对照组、UVB照射组、UVB照射＋人参皂苷Rg1组(5，10和20 μg/mL)，MTT法检测细胞增殖活性，ELISA法检测细胞中SOD活性、MDA和细胞上清液中MMP－1和MMP－3的含量，Western blot法检查细胞中MMP－1和MMP－3的表达。结果: UVB联合不同浓度人参皂苷Rg1组较UVB照射组，细胞SOD活性升高，MDA、MMP－1和－3含量均有不同程度下降，人参皂苷Rg1浓度越高作用越明显。结论: 人参皂苷Rg1对UVB造成的皮肤成纤维细胞损伤具有保护作用。

人参皂苷Rg1； 皮肤成纤维细胞； UVB

中波紫外线(UVB)能够到达皮肤真皮层，成纤维细胞是真皮中主要的组成细胞，也是UVB照射的靶细胞。研究发现，在急性光损伤过程中，UVB通过破坏DNA、激活诱导活性氧簇分子(reactive oxygen species，ROS)和炎症介质等损伤皮肤成纤维细胞，其中ROS还能促进基质金属蛋白酶－1(MMP－1)和MMP－3的生成而破坏细胞外基质加重损伤作用。人参皂苷Rg1能够有效减轻氧化应激作用而保护多种细胞，1，2但在UVB照射引起皮肤成纤维细胞急性损伤过程中，它是否能够发挥保护作用的研究报道较少，所以，我们探讨了人参皂苷Rg1在UVB诱导皮肤成纤维细胞损伤的作用及机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基和胰酶购自美国 Gibco BRL公司；胎牛血清购自北京燕生政博生物技术有限公司；人参皂苷Rg1购自中国药品生物制品检定所；SOD活性检测试剂盒和MDA检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，MMP－1和MMP－3 ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司，GAPDH、MMP－1和MMP－3一抗购自Santa Cruz公司，HRP标记的二抗购自Abgent公司，酶标仪为BioTek ELX 800。

1.2 细胞培养 健康青少年男子包皮环切术切除的包皮，加入0.25%胰酶消化，取出消化后的包皮组织将表皮剥离，加入PBS，将组织剪碎、吹打，离心含细胞的PBS悬液，弃上清，加入DMEM培养基(含10%

FBS)，接种于培养皿内，置于37℃ 5%CO2孵箱中，次日更换培养基。每3～4 d更换1次培养基，当细胞生长融合成片达70%～80%时，进行传代，将处于对数生长期的细胞(第3～6代)用于研究。细胞分为正常对照组、UVB照射组、UVB照射＋人参皂苷Rg1组(浓度分别为5、10和20 μg/mL)，按照不同组别接受药物和(或)照光，药物处理组照光前24 h培养液中加入药物培养，照光后继续培养48 h。

1.3 UVB照射细胞 细胞生长至70%～80%融合时，弃培养基，用温PBS冲洗2次，加入适量PBS，用150 mJ/cm2UVB照射，照射后立即将PBS换成培养基，置37℃、5%CO2孵箱中培养48 h。光源为Waldmann UV800K(德国Herbert Waldmann GmbH＆Co.) UVB照射剂量＝UVB光强×照光时间。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性 将皮肤成纤维细胞以每孔5×103个细胞接种于96孔板，当细胞生长至70%～80%融合时，将每孔中细胞的上清弃去，加入80 μL PBS，照射UVB，照射后立即将各孔中的PBS换成150 μL培养基，置37℃、5%CO2孵箱中培养48 h。在实验结束前4 h，每孔中分别加入20 μL、5 mg/ mL MTT溶液，孵育4 h后吸除上清，各孔中加入100 μL DMSO，室温振荡15 min，使孔底部颗粒状物质溶解，酶标仪检测结果并分析。

1.5 细胞SOD活性和MDA含量测定 收集细胞，用冷PBS清洗并裂解，4℃离心，取部分上清测定蛋白浓度后，将上清加入试剂盒，37℃孵育20 min，使用酶标仪测定吸光度，根据试剂盒说明书计算结果。

1.6 ELISA检测细胞上清液中MMP－1和MMP－3含量 将细胞培养液加至96孔板，37℃孵育2 h，加入一抗37℃孵育1 h，洗板，加入二抗37℃孵育1 h，洗板，加入底物室温孵育30 min，终止反应，酶标仪检测结果并分析。

1.7 Western blot检测细胞MMP－1和MMP－3表达收集细胞，PBS洗涤细胞两次，加适量细胞裂解液，4℃裂解细胞并收集总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量变性的蛋白样品，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至醋酸纤维素膜，PBS液洗膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，PBS洗涤，加入一抗(浓度分别为MMP－1 1∶200，MMP－3 1∶200，GAPDH 1∶200)过夜孵育，次日二抗(1∶2000)室温孵育，PBS洗涤，ECL发光液显影，用荧光成像仪采集图像并分析。设分子量为37 KD的GAPDH为内参。

1.8 统计学方法 用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，多组间均数比较行单因素方差分析；P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg1增加UVB照射后皮肤成纤维细胞增殖活性 与正常对照组相比，照射150 mJ/cm2UVB后48 h，皮肤成纤维细胞的增殖活性明显下降至73%；UVB照射联合人参皂苷Rg1培养细胞，皮肤成纤维细胞的增殖活性逐渐增强，UVB＋20 μg/mL人参皂甙Rg1培养组细胞活性上升至95%(图1)。

图1 UVB与不同浓度人参皂苷Rg1联合处理对皮肤成纤维细胞活性的影响

2.2 人参皂苷Rg1增加UVB照射后皮肤成纤维细胞中SOD活性和降低MDA含量 与正常对照组相比，照射150 mJ/cm2UVB后，皮肤成纤维细胞SOD活性下降为51.5±4.7 U/mg，MDA含量升高至136.8± 13.7 μmol/mg。UVB照射联合不同浓度人参皂甙Rg1处理细胞后，皮肤成纤维细胞的SOD活性上升，MDA含量降低，以UVB＋20 μg/mL人参皂甙Rg1培养组改变最明显，SOD活性为75±5.7 U/mg，MDA含量为80.3±6.6 μmol/mg(图2)。

2.3 人参皂苷Rg1降低UVB照射后皮肤成纤维细胞MMP－1和－3的含量 与正常对照组相比，150 mJ/cm2UVB照射后48 h，皮肤成纤维细胞胞质和上清液中MMP－1和－3明显增加，上清液中MMP－1和－3含量分别为76.0±11.6 ng/mL和50.7±7.4 ng/mL；UVB照射联合人参皂甙Rg1培养细胞后，皮肤成纤维细胞胞质和上清液中MMP－1和－3含量出现不同程度的降低，UVB＋5 μg/mL人参皂甙Rg1组上清液中MMP－1和－3分别为61.7±8.5 ng/mL和49.3±8.1 ng/mL，UVB＋10 μg/mL人参皂甙Rg1组上清液中MMP－1和－3分别为42.3±5.7 ng/mL和45.3±4.5 ng/mL，UVB＋20 μg/mL参皂甙Rg1组上清中上清液中MMP－1和－3分别为36.7±7.8 ng/mL和35.7±6.0 ng/mL(图3)。

图2 人参皂苷Rg1增加UVB照射皮肤成纤维细胞的SOD活性(A)和降低MDA含量(B)

图3 人参皂苷Rg1降低UVB照射后皮肤纤维细胞MMP－1和－3的含量

4 讨论

目前认为，UVB对皮肤急性光损伤发挥着主要作用，它通过氧化作用损伤皮肤成纤维细胞，其机制为UVB引起细胞内过氧化氢、氢氧根自由基等活性氧簇分子(ROS)的产生，导致蛋白质和脂类物质破坏，影响细胞功能，造成皮肤光损伤。皮肤中的过氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的内源性抗氧化酶，能够对抗ROS诱导的细胞损伤；MDA是脂质过氧化的标志，3其含量随着UVB照射剂量的增加而上升。4，5人参皂苷Rg1是人参的主要活性成分之一，它通过抑制一氧化氮合酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化氢酶等多种酶活性，清除自由基，提高SOD和谷胱甘肽的活性，1，2发挥抗氧化、抗衰老的作用。在皮肤成纤维细胞急性光损伤过程中，人参皂苷Rg1是否发挥保护作用仍不清楚，本研究发现，在UVB照射后的皮肤成纤维细胞中，人参皂苷Rg1可以改善SOD的活性，同时人参皂苷Rg1还能减轻UVB导致的脂质过氧化，这表明人参皂苷Rg1可以降低UVB引起的皮肤成纤维细胞的氧化损伤。

ROS不仅通过氧化作用直接损伤细胞，还能通过促进MMPs的合成而损伤皮肤细胞。迄今为止，共发现26种MMPs，其中MMP－1和－3的作用尤为重要。研究显示，体外培养的人皮肤成纤维细胞经UVB照射后，细胞ROS生成增加导致MMP－1和－3表达增多，5，6MMP－1可水解I型和III型胶原纤维，当这两种胶原纤维被MMP－1切断后，MMP－3能够继续降解断裂的胶原纤维，同时MMP－3还能激活其他的基质金属蛋白酶，7，8从而降解真皮中的胶原纤维等多种细胞外基质，导致正常皮肤结构发生改变。我们研究发现，在皮肤成纤维细胞中，人参皂苷Rg1抑制UVB诱导产生的MMP－1和－3，进一步减轻后者引起的细胞急性光损伤。

总之，在UVB引起的皮肤成纤维细胞损伤过程中，人参皂苷Rg1通过其增强细胞的抗氧化能力和降

低MMP－1及－3的生成，从而发挥保护细胞的作用，但是，人参皂苷Rg1是否通过作用于其他分子而保护细胞，仍需进一步深入研究。

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(收稿:2014－06－23)

Protective effects of ginsenoside Rg1 against UVB－induced photo－damage on skin fibroblasts

LIU Yong，XU Hao-xiang，HUI Yun，et al.Department of Dermatology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People’s Hospital，Urumqi，830002

Objective:To determine the protective effects of ginsenoside Rg1 against UVB－induced photodamage on skin fibroblasts.Methods:Human skin fibroblasts cultured in vitro were divided into normal control group，UVB group，UVB combined ginsenoside Rg1 groups(concentration of 5，10 and 20 μ g/mL). The proliferation activity of cells was detected by MTT assay.SOD activity，MDA and the content of MMP－1 and MMP－3 were detected by ELISA.The expression of MMP－1 and MMP－3 proteins was detected through Western blot.Results:The SOD activity in UVB combined ginsenoside Rg1 groups was higher than that in UVB group.The content of MMP－1 and MMP－3 in UVB combined ginsenoside Rg1 groups was lower than that in UVB group.The effect was dose dependent.Conclusion:Ginsenoside Rg1 can protect the dermal fibroblasts from UVB damage.

ginsenoside Rg1；dermal fibroblasts；UVB

国家自然科学基金资助项目(编号:81101207，81472905)教育部高校博士点基金(编号:20111106120052)中央高校基本科研业务费专项资金＆北京协和医学院青年基金(编号:3332013056)杨森科研基金(编号:JRCC2011－皮－01)

1新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科，乌鲁木齐，830002 2中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京，210042 3江苏省皮肤与性病分子生物学重点实验室，南京，210042 4南京军区南京总医院皮肤科，南京，210042

☆共同第一作者

∗通信作者